金樱叶总黄酮提取工艺和黄酮类成分含量测定的研究

胡美英，余中霞，张继红，黄道明

上饶市检验检测认证院药品检测分院，江西 上饶 334000

金樱叶在我国西南、中南、华东等地区均有分布，系蔷薇科植物金樱的嫩叶［1］，具有清热解毒、活血止血之功效，主治金疮、溃疡、烫火伤、闭经等，也常用于治疗烧烫伤及外伤性出血，是古方“军中一捻金”的主要药味之一［2］。研究［3-6］显示，金樱叶中含有黄酮、三萜、酚酸、皂苷等多类化合物，具有抗炎消肿、抗肿瘤、促进血管内皮细胞生长等多种作用［7］，是民间常用一味中药。

中药在治疗和预防疾病上发挥着重要作用。我国中药资源种类繁多、分布广泛、产量丰富，但很多中药非常用部位在生产加工过程中被丢弃，资源未得到充分使用，产出与药用失衡。金樱叶资源丰富，药用历史悠久，疗效确切可靠，所含的黄酮类成分具有显著的抗肿瘤、抗炎活性［8］，但在收集时往往被扔掉，未得到充分利用，深入研究金樱叶意义重大。本试验以金樱叶为研究对象，应用响应面法对金樱叶总黄酮的提取工艺进行优化，应用HPLC 法对金樱叶中芦丁和槲皮素的含量进行测定，以期为金樱叶资源的进一步开发利用奠定基础。

1 仪器与试药

Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；UV5500 紫外-可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）。对照品芦丁（批号111081-201202，纯度99.2%）以及槲皮素（批号100081-201608，纯度99.6%）均购自中国食品药品检定研究院。金樱叶采自江西医学高等专科学校植物园，经上饶市检验检测认证院药品检测分院黄道明副主任药师鉴定为蔷薇科植物金樱Rosa laevigataMichx.的嫩叶。

2 方法与结果

2.1 金樱叶中总黄酮的提取工艺优化

2.1.1 标准曲线的绘制精密称取芦丁适量，制得浓度为0.1 mg/mL 的对照溶液。参照文献［9］方法，于510 nm 波长处测定吸光度，得回归方程为A=9.763C+0.032（r=0.999 8）。

2.1.2 样品含量的测定精密称取金樱叶粉末1.0 g，按一定的方法制备供试品溶液，按照“2.1.1”项下测定其吸光度值，计算其总黄酮含量。总黄酮得率=（Y-0.032）×10×V×100/（9.763×m×1 000）。式中：Y为吸光度值；10 为稀释倍数；V 为提取液体积；m 为样品质量。

2.1.3 单因素考察以总黄酮得率为评价指标，分别对乙醇浓度（40%、50%、60%、70%、80%），超声时间（30、45、60、75、90 min），提取温度（50、60、70、80、90 ℃），液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1）进行考察。结果见图1。由图1 可知，在以50%乙醇、超声60 min、提取温度70 ℃、液料比25∶1 的条件下总黄酮提取效果最佳。

图1 单因素实验结果：A.乙醇溶度；B.超声时间；C.提取温度；D.液料比

2.1.4 响应面设计在单因素试验的基础上，以乙醇浓度、超声时间、提取温度、液料比4 个因素为总黄酮提取影响的考察因素，设计总黄酮提取条件，设计方案和结果见表1 和表2。

表1 响应面法(Box-Behnken)试验设计因素与水平表

表2 响应面设计结果

2.1.5 方差分析金樱叶总黄酮的提取率对4 个考察因素的回归方程为：Y=8.82+0.67A+0.39B+0.61 C+0.40D+0.11AB-0.39AC-0.41AD-0.25BC-0.22BD-0.30CD-0.85A2-0.88B2-1.03C2-0.51D2。结果显示，在设定的区域内，所建立的模型达到极显著水平（P<0.01），其中二次项中A、C、A2、B2、C2的P值均达到了极显著水平（P<0.01），表明方程拟合较好。方差分析结果见表3。

表3 方差分析结果

2.1.6 响应面分析通过Design-Expert 9.0.4 软件绘制考察指标与自变量之间的等高线图，具体见图2。结果所得最佳提取工艺为：乙醇浓度53.2%、超声时间62.95 min、提取温度71.8 ℃、料液比25.8∶1，此条件下总黄酮得率为9.06%。

图2 不同因素间的响应曲面图

2.1.7 验证试验考虑实际操作可行性，将预测到的条件修正为：乙醇浓度53%、超声时间63 min、提取温度72℃、料液比25∶1，此条件下总黄酮得率为9.03%，与预测值差异无统计学意义，表明方程与实际情况拟合良好，提取工艺稳定可靠。

2.2 金樱叶中芦丁和槲皮素的含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备取芦丁、槲皮素对照品适量，置100 mL 量瓶中，加80%甲醇溶解，定容，摇匀，得浓度分别为316.5、88.2 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备精密称取干燥后的金樱叶粉末1.0 g，置具塞锥形瓶中，精密加入10 mL80%甲醇，称定重量，超声处理30 min，冷却，再称定重量，用80%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，即得。

2.2.3 专属性试验色谱柱：Agilent Extend C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），采用梯度洗脱（0～20 min，10%→28%A；20～45 min，28%→60%A），检测波长：360 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。分别取混合对照品溶液和供试品溶液进样分析，HPLC图如图3所示，各成分分离度较好。

图3 液相色谱图：A.对照品；B.金樱叶供试品

2.2.4 线性关系精密吸取混合对照品溶液0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mL，置10 mL 量瓶中，加入80%甲醇定容至刻度。分别吸取10 μL 注入液相色谱仪测定，以浓度X 为横坐标，峰面积Y 为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表4。

表4 回归方程和线性关系

2.2.5 精密度试验取同一份供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件重复测定6 次。结果芦丁和槲皮素的峰面积RSD 分别为1.52%、1.98%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验取同一份供试品溶液，分别在0、2、4、8、10、12、24 h 进样分析。结果芦丁和槲皮素的峰面积RSD 分别为1.46%、1.65%，表明供试品溶液24 h 内稳定。

2.2.7 重复性试验取干燥后的金樱叶粉末6 份，按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，按“2.2.3”项下色谱条件测定。结果芦丁和槲皮素含量的RSD 分别为1.02%、2.36%，表明重复性良好。

2.2.8 加样回收试验取干燥后的金樱叶粉末6 份，每份约0.5 g，精密称定，加入适量的芦丁和槲皮素对照品，测定含量并计算回收率，结果见表5，表明建立的方法准确可靠。

表5 加样回收率测试结果

2.2.9 含量测定按“2.2.2”项下方法平行制备3 份金樱叶供试品溶液，吸取10 μL 注入液相色谱仪测定含量，测得芦丁含量为1.168 mg/g，槲皮素含量为0.062 mg/g。

3 讨论

目前，对于中药有效成分的提取工艺优化，主要有正交试验法和响应面法。正交法只是试验所用水平的某一种组合，结果具有局限性。响应面法可对系列数据进行多项拟合，能直观地分析出各个因素之间交互关系，所得结果更精确，已广泛用于有效成分的提取工艺优化［11］。本实验通过响应面法优选了金樱叶总黄酮提取工艺，所得金樱叶总黄酮提取率为9.03%，比正交法优化的条件所得的8.67%提取率更优。此外，对于金樱叶的研究，目前主要集中在化学成分和药理作用方面，对其质量控制和有效成分的含量测定研究还未见报道，本试验建立了金樱叶中芦丁和槲皮素2 个黄酮类成分的含量测定方法，所建立的方法准确可靠、操作简便、重现性高、稳定性好、专属性强，可为后续金樱叶的资源利用、产品开发、质量控制等研究提供依据。