Plackett-Burman 联用星点设计-效应面法优化龙胆苦苷脂质体制备工艺的研究

张卫敏，贾莉，赵鲁亚，李丽平，李伟男

1.菏泽医学专科学校，山东 菏泽 274000；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040

龙胆苦苷（gentiopicroside，GPS）是中药龙胆的活性成分，具有突出的抗肿瘤药理作用，可通过MAPK/Akt 途径抑制宫颈癌的侵袭转移，是宫颈癌治疗的潜力药物［1］。但是，GPS 分子极性大，易被体内生物活性酶水解，在体内消除较快，实验发现在大鼠体内半衰期仅为0.64 h，因此导致药效发挥不良［2］。

脂质体（liposome，L）是将磷脂双分子定向排列而成的囊泡，它以微粒形式包载水溶性药物，是一种改善水溶性药物体内分布的常用技术［3］。脂质体具有高效、低毒、靶向性强等优点，且作为一种成熟的药物递送载体已被广泛应用于抗肿瘤、抗感染、疫苗等多种制剂的制备［4］。目前已有采用正交实验优化载龙胆苦苷脂质体的相关报道，虽然正交优化实验次数少，但精度低、可考察因素与水平数较少且不可预测最优实验方案［5］。而Plackett-Burman（PBD）具有考察因素多、水平少的特点，可全面筛选显著影响的因子。同时星点设计-效应面法（CCD-RSM）能进行交互实验，多水平预测最优方案与结果［6］。PBD 与CCD-RSM 两种设计方法联合指导实验可获得精度更高、可靠性强的优化结果。较小粒径的脂质体能延长体内循环时间，对药效发挥具有积极作用，同时包封率（EE）也是影响脂质体疗效的关键因素。本研究以粒径（size）、包封率为指标考察载龙胆苦苷脂质体（L/GPS）的制剂学特征，采用PBD 联用CCD-RSM 对制备条件进行筛选，能够获得包封率高、粒径尺寸合适的L/GPS。

1 材料与仪器

龙胆苦苷原料药（上海默克，CAS：0831-76-9，纯度98%）；龙胆苦苷标准品（上海科兴商贸有限公司）；大豆磷脂（天津富宇精细化工有限公司）；胆固醇（上海默克）；磷酸盐缓冲液（PBS，武汉塞维尔科技公司）；其他试剂均为分析纯。

XPR106DUHQ/AC 型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；UV2450 型紫外分光光度计（日本岛津科技公司）；EXER1050 型旋转蒸发仪（华宸仪器公司）；GHH-Q8000-P25 型高压均质机（上海顺仪仪器公司）；LC-10N-50A 型冷冻干燥机（力辰科技有限公司）；Mastersizer 3000 型粒径仪（英国马尔文仪器公司）。

2 方法

2.1 GPS 体外分析方法建立

精密称取GPS 标准品，配制出质量浓度在5.0µg/mL～50.0 µg/mL 系列浓度5 个标准品溶液。根据文献［7］报道，采用紫外分光光度法（UV-Vis），在空白脂质体无吸收的270 nm 下测定各浓度标准品溶液的吸光度（A）。以GPS 的浓度（C）为横坐标（X），A 为纵坐标（Y）建立线性标准。分别配制5.0、25.0、50.0 µg/mL 的GPS 标准品溶液，进样5 次，计算日内和日间精密度，采用同样标准品浓度测定加样回收率［8］。

2.2 L/GPS 脂质体的制备方法

采用制备载水溶性药物脂质体的逆向蒸发法进行实验［9］。称取相应比例的大豆磷脂与胆固醇，加入6 mL 乙醚超声溶解。量取3 mL 溶解有不同质量GPS 的磷酸盐缓冲液，缓慢滴入含有脂质体原料的乙醚溶液中，在一定温度条件下恒温超声10 min，得到W/O 型白色乳状液体。放入茄形瓶后减压除去有机溶剂，浓缩得到浓稠胶状液体，加入5 mL PBS水化一定时间后，减压蒸发除水，得到淡黄色液体，高压均质后用0.22 μm 滤器过滤后冷冻干燥，即得。

2.3 L/GPS 脂质体EE 的测定

称取一定质量L/GPS 冻干粉末溶解于pH 7.4 的PBS，放置于已活化的透析袋（10 000 Mw）中，并将该装置放入500 mL 烧杯中，控制漏槽条件，在摇床中保持100 rpm 转速透析2 h，取透析介质用上述体外分析方法测定A，计算游离GPS 含量（w2）。称取同质量L/GPS 冻干粉末溶解放入甲醇破乳后稀释，于270 nm 测定A，计算总GPS 含量（w1）［10］。按以下公式计算EE：

2.4 L/GPS 脂质体粒径的测定

取不同条件下制备得到的L/GPS 脂质体各0.5 mL，分别用蒸馏水稀释10 倍，吸取稀释液1.5 mL放入粒径样品池中，粒径仪预热半小时后测定对应方法制备的脂质体粒径。

2.5 PBD 实验设计

根据预实验确定主要影响因素5 个，分别为有机相与水相体积比（A）、水化时间（B）、载药温度（C）、磷脂与胆固醇比（D）、药物与磷脂比（E）。采用Design-Expert 软件进行实验设计及数据处理，两水平（+1，-1）进行实验，因变量为size 与EE，设计安排见表1。

表1 PBD实验因素与水平

2.6 CCD-RSM 优化实验设计方案

采用逆向蒸发法制备L/GPS，PBD 实验筛选出三种影响脂质体质量最显著的因素，即载药温度（A）、药脂比（B）、胆脂比（C）。载药温度为有机相与含药溶液混合制备W/O 乳液时的温度，以25 ℃至45 ℃为该因素的水平范围；药脂比为GPS与磷脂的质量比，范围0.01 至0.05；胆脂比是胆固醇与磷脂的质量比，范围0.3 至0.7。分别以size（Y1）与EE（Y2）为响应参数，各水平下因素值（α=1.682）进行实验，使用Design-Expert 11 软件进行数据处理。试验安排见表2。

表2 CCD-RSM实验安排

3 结果

3.1 GPS 体外分析方法建立结果

吸光度与GPS 浓度线性关系的回归结果见图1，表明GPS 在5.0 µg/mL～50.0 µg/mL 浓度范围内符合线性关系要求。以50.0 µg/mL、25.0 µg/mL、5.0 µg/mL 三种浓度测定的日内精密度RSD 分别为0.71%、0.86%和1.52%（n=5），日间精密度RSD值分别为1.45%、1.62%和1.79%，RSD 均小于2.0%，显示此种方法的日间和日内精密度较好。此种测定方法的加样回收率结果分别为98.21%、98.37%和100.7%（n=3），可认为载体材料对GPS 含量测定无影响［11］。

图1 GPS浓度与吸光度线性回归关系图

3.2 PBD 优化实验结果

实验结果见表3，方差分析见表4。方差分析结果中模型P 值显著，显示Y1、Y2拟合度较高，误差较小。C、D 因素对粒径（Y1）影响显著，因素E 对包封率（Y2）影响显著，因此选择该三种因素进行下一步处方与工艺的筛选。载药温度（A）与胆脂比（C）影响脂质体的形成与稳定性，并非越高越好，并对粒径大小极为重要，同时药脂比（B）过高可由于包封能力的限制而降低包封率。根据实验结果进行拟合得到Y1、Y2方程如下。

表3 PBD实验结果

表4 实验设计的方差分析

3.3 CCD-RSM 优化处方结果

3.3.1 实验结果模拟拟合对A、B 和C 三种响应因素对size、EE 的影响情况进行考察，实验结果见表5。并以Y1、Y2为因变量，A、B、C 为自变量，对实验数据构建二次多项式回归方程拟合。方程如下。

表5 CCD-RSM实验结果

方差分析结果见表6。依据软件拟合的Y1、Y2方程中方差分析结果显示两种拟合模型均具有统计学意义。评价指标Y1所属方程中A2与C2对Y1有显著影响，C2影响极显著；在评价指标Y2中B 与A2对Y2有显著影响，并且A2影响极为显著。综合表中数据确定，控制size 的因素影响大小为：C>A>B，控制EE 的因素影响顺序为：A>B>C。分析原因可能为，胆脂比（C）作为影响脂质体成膜的关键因素，过高会导致size 过大，过低则难以形成稳定的脂质体结构，因此成为影响size 的最显著因素。载药温度（A）是药物在水化过程的温度，温度升高药物溶解度增加，进而提高EE，同时温度过高易导致脂质体泄漏，EE 降低，因此是影响EE 的最显著因素［12］。

表6 方差分析结果

3.3.2 三维效应面图与最优处方预测以size（Y1）、EE（Y2）作为L/GPS 质量的评价指标，拟合方程绘制得到的三维效应面图，如图2。根据拟合软件分析其结构，得到最优制备条件为：载药温度（A）为34 ℃、药脂比（B）为0.05、胆脂比（C）为0.52。

图2 A、B、C对size与EE影响的三维效应面图：（a）A与B对size的影响；（b）A与C对size的影响；（c）B与C对size的影响；（d）A与B对EE的影响；（e）A与C对EE的影响；（f）B与C对EE的影响

3.4 最优处方工艺验证结果

将PBD 联用CCD-RSM 筛选而得的最优方案进行可靠性和准确性验证。制备等量的3 批L/GPS 脂质体，实验验证结果所得脂质体size 为（92.44±1.80）nm、EE 为（87.70±2.60）%。该L/GPS 脂质体size 较小，EE 值较高，表明经过筛选后得到的最优工艺条件制备方案可靠、可行，实验结果展示良好的制剂学特性。

4 讨论

GPS 是一种天然的环烯醚萜苷，具有突出的抗肿瘤药理作用。但是，GPS 分子极性大，易被体内生物活性酶水解，在体内消除较快，使其广泛应用受到限制，而脂质体可以加强GPS 在肿瘤部位的富集，解决龙胆苦苷水溶性差和生物利用度低的问题，能延长体内循环时间，提高抗癌效果，降低药物的毒副作用，对药效发挥具有积极作用［13］。

本研究采用的逆向蒸发法是制备水溶性药物脂质体的常用手段，所得到的载药脂质体包封率普遍较高［14］。该制备技术简单，设备需求水平较低，因此适合工业化生产。正交试验适合水平数不高的实验，使用普通统计学方法计算实验结果，实验次数安排局限，无法模拟出最优条件下的未做实验结果［15］。运用PBD 联合CCD-RSM 设计实验方案可全面认识实验数据的趋势与内涵，非线性拟合方式可在各因素下全面进行科学考察，所得最优工艺参数更可靠。该方法优势在于，在可靠因素范围内对未做实验进行结果预测，简化因素的筛选方案［16］。在脂质体制备中，载药温度需要控制在合适范围内，过低导致脂质膜流动性低，难以包封药物，过高则脂质体整体稳定性下降，药物泄漏导致EE 降低［17］。胆脂比过高或过低也会影响脂质体的形成与最终质量，从而影响EE 与size 的大小［18］。本研究运用PBD 联用CCD-RSM 优化筛选最优因素制备的GPS脂质体，EE 值较高，所得size 值较低，为纳米级尺寸，为进一步制备龙胆苦苷脂质体奠定了基础。