美味牛肝菌汤的熬制工艺及风味基料配方研究

杨 豪，杨圆慧，李为兰，资璐熙，徐柠檬，郭 磊*

（西南林业大学 生命科学学院，云南 昆明 650224）

美味牛肝菌（Boletus edulisBull.Fr.）是珍稀的肉质大型真菌，在我国主要分布于西部地区[1-2]。美味牛肝菌兼具食药用价值，含有蛋白质、氨基酸、维生素等多种营养成分及多糖、多酚和黄酮等多种活性成分[3-5]，具有抗氧化、增强免疫力、预防肿瘤细胞增殖、调节肠胃、促消化、清热解毒、增强机体清除自由基的能力、抑制肥胖等多种生理功能[6-9]。美味牛肝菌的风味成分主要由挥发性的呈香成分和非挥发性呈味成分组成。挥发性呈香成分主要包括醇、酮、酸、酯、醛、烃类化合物等，组成了美味牛肝菌的特征风味，其中苯甲醛呈现出樱桃和坚果气味，己醛呈现出果香、花香、木香和叶香等[10-13]。目前，顶空固相微萃取-气相色谱-质谱（headspace solid phase microextraction-gas chromatographymass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）已广泛应用于检测果蔬中的挥发性风味物质，具有方便快捷、灵敏度高、选择性与重复性好的特点[14-15]。非挥发性呈味成分主要包括呈味核苷酸、有机酸、可溶性糖等，其中呈味核苷酸和有机酸可增添口感层次，可溶性糖可产生甜味[16-17]。

我国美味牛肝菌资源丰富，固体风味基料能够较好地保持美味牛肝菌特有的天然风味，提高人们对食品的接受度，也符合食品工业健康营养的要求[18-19]。因此，本研究以料液比、熬制温度、熬制时间为自变量，以蛋白质溶出率为响应值，在单因素试验基础上，采用响应面试验优化美味牛肝菌汤的最佳熬制工艺；以美味牛肝菌汤冻干粉为基料，采用HS-SPME/GC-MS分析其挥发性风味物质组成，并采用均匀设计优化美味牛肝菌汤风味基料的配方，为美味牛肝菌汤及其固体风味基料的工业化生产提供一定的理论基础。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

美味牛肝菌：2022年6月购自云南玉溪易门；牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250、氯化钠（均为分析纯）：上海励瑞生物技术有限公司；食盐、白砂糖、味精、柠檬酸：市售。

1.2 仪器与设备

FA1004型电子天平：上海精密科学仪器有限公司；DZF-6020型真空干燥箱：上海博迅实业有限公司；YB-250A型高速多功能粉碎机：永康市速锋工贸有限公司；UV-VIS 300紫外分光光度计：美国赛默飞世尔科技有限公司；HH-2数显电子恒温水浴锅：北京康光仪器有限公司；YTLG-12A型真空冷冻干燥机：上海叶拓科技有限公司；7890B气质联用仪：美国Agilent公司；57328-U型50/30 μmDVB/CAR/PDMS固相微萃取头：美国Supelco公司。

1.3 试验方法

1.3.1 美味牛肝菌汤的熬制工艺流程

美味牛肝菌→清洗→晾干→切片→真空干燥→粉碎→熬煮→菌汤

操作要点[20]：挑选新鲜美味牛肝菌，洗净后沥干水分，切成厚度约为0.5 cm的片状，70 ℃条件下真空干燥8 h，粉碎后过60目筛后备用。取美味牛肝菌粉1 g，按照料液比1∶70（g∶mL）加入去离子水，密封，70 ℃熬制55 min，待熬制试验结束后，过滤去渣后得到滤液，即为美味牛肝菌汤。

1.3.2 美味牛肝菌汤熬制工艺优化

（1）单因素试验

设置基础条件为料液比1∶70（g∶mL）、熬制温度70 ℃、熬制时间55 min，探究不同料液比（1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90（g∶mL））、熬制温度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃）、熬制时间（35 min、45 min、55 min、65 min、75 min、85 min）对美味牛肝菌汤蛋白质溶出率的影响。

（2）响应面试验

在单因素试验结果基础上，以料液比（A）、熬制温度（B）和熬制时间（C）为自变量，蛋白质溶出率（Y1）为响应值，使用Design-Expert 13软件进行3因素3水平的响应面优化设计，试验因素与水平见表1。

表1 美味牛肝菌汤熬制工艺优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for cooking process optimization of Boletus edulis soup

1.3.3 蛋白质溶出率的计算

采用凯氏定氮法[21]对美味牛肝菌中的蛋白质总含量进行测定。采用考马斯亮蓝法[22]对菌汤中的可溶性蛋白质含量进行测定，计算蛋白质溶出率，其计算公式如下：

式中：C1为菌汤中蛋白质含量，mg/mL；V1为菌汤体积，mL；M为蛋白质总含量，mg。

1.3.4 美味牛肝菌汤冻干粉挥发性风味物质分析

将美味牛肝菌汤冻结放入真空冷冻干燥机内，干燥24 h得美味牛肝菌汤冻干粉。参考FENG T等[23]的HS-SPME-GCMS法略微修改，测定美味牛肝菌汤冻干粉挥发性风味物质。

萃取头老化：采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头，初次使用时需在GC进样口以250 ℃老化30 min，之后每次使用前均老化10 min。

HS-SPME条件：称取美味牛肝菌冻干粉样品0.500 g于20 mL顶空瓶中，在79 ℃条件下萃取28 min后，将老化好的萃取头插入顶空瓶吸附23 min，然后迅速将萃取头插入气相色谱进样口进行解吸。

GC条件：HP-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），载气为高纯氦气（He），流速1.0 mL/min，不分流模式进样，进样口温度250 ℃。升温程序为初始温度40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升温至260 ℃，保持2 min。

质谱条件：电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV，传输线温度250 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，扫描方式为全扫描，30～400 m/z。

定性、定量分析：经美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）Library 14.0谱图库检索，并结合相关文献报道确定其成分，相对百分含量按峰面积归一化法计算[24]。

1.3.5 美味牛肝菌汤固体风味基料配方优化均匀试验

以美味牛肝菌冻干粉为基料，参考费英敏等[25]的试验设计，以食盐（X1）、白砂糖（X2）、味精（X3）、柠檬酸（X4）为辅料，以感官评分（Y2）为评价指标，采用Excel 2021设计U9（95）均匀试验优化固体风味基料的配方，试验因素与水平见表2。

表2 美味牛肝菌固体风味基料配方优化均匀试验因素与水平Table 2 Factors and levels of uniform tests for formula optimization of Boletus edulis solid flavor base material

1.3.6 美味牛肝菌固体风味基料的感官评价

以美味牛肝菌汤冻干粉为原料调配固体风味基料，由10名（男性女性各5名）经过专业培训的感官评价人员组成评价小组，从香味、滋味及色泽三个方面对其进行感官评价。在感官评价过程中，对样品进行随机编号，使感官评价人员进行独立客观的评价，具体感官评分标准见表3[26]。

表3 美味牛肝菌固体风味基料感官评分标准Table 3 Sensory score standards of Boletus edulis solid flavor base material

1.3.7 数据分析

所有数据均平行测定3次，结果以“平均数±标准差”表示。试验数据处理由Excel 2021完成，作图由Origin 2017和Design-Expert 13完成，方差分析由SPSS 20.0完成。

2 结果与分析

2.1 美味牛肝菌汤熬制工艺优化单因素试验

2.1.1 料液比对美味牛肝菌汤蛋白质溶出率的影响

料液比对美味牛肝菌汤蛋白质溶出率的影响见图1。由图1可知，美味牛肝菌汤中蛋白质溶出率随料液比的增加呈现先急剧增加后趋于减小的趋势，当料液比为1∶70时，蛋白质溶出率达到最高，为18.11%。料液比越小，美味牛肝菌与溶剂混合越充分、均匀，溶质分子更容易分散于溶剂中，有利于蛋白质溶出，但原料中蛋白质含量是一定的，存在溶解平衡，当料液比持续减小时蛋白质溶出率不会进一步增加，反而会呈现降低的趋势[27]，故确定最佳料液比为1∶70（g∶mL）。

图1 料液比对美味牛肝菌汤蛋白质溶出率的影响Fig.1 Effect of solid and liquid ratio on the protein dissolution rate of Boletus edulis soup

2.1.2 熬制温度对美味牛肝菌汤蛋白质溶出率的影响

熬制温度对美味牛肝菌汤蛋白质溶出率的影响见图2。由图2可知，随熬制温度的升高，美味牛肝菌汤中的蛋白质溶出率呈先增大后减小的趋势，当熬制温度为70 ℃时，蛋白质溶出率达到最大，为18.34%，分析原因可能是由于高温条件下蛋白质会变性造成溶解度下降[28]，故确定最佳熬制温度为70 ℃。

2.1.3 熬制时间对美味牛肝菌汤蛋白质溶出率的影响

熬制时间对美味牛肝菌汤蛋白质溶出率的影响见图3。由图3可知，美味牛肝菌汤的蛋白质溶出率随着熬制时间的延长呈先增大后减小的趋势，当熬制时间为45 min时，蛋白质溶出率最大，达18.77%，此时菌汤中含氮化合物含量最高。熬制时间＞45 min后，蛋白质溶出率急剧下降，可能是蛋白质在长时间熬制下发生水解反应，蛋白质的水解速率大于溶出速率[29]，导致蛋白质溶出率降低，因此，确定最佳熬制时间为45 min。

图3 熬制时间对美味牛肝菌汤蛋白质溶出率的影响Fig.3 Effect of cooking time on the protein dissolution rate of Boletus edulis soup

2.2 美味牛肝菌汤熬制工艺优化响应面试验结果及分析

2.2.1 响应面回归模型的建立及分析

在单因素试验结果的基础上，以料液比（A）、熬制温度（B）和熬制时间（C）为自变量，蛋白质溶出率（Y1）为响应值，采用Design-Expert 13设计3因素3水平的响应面优化试验，试验设计及结果见表4，方差分析见表5。

表4 美味牛肝菌汤熬制工艺优化响应面试验设计与结果Table 4 Design and results of response surface tests for cookingprocess optimization of Boletus edulis soup

采用Design-Expert 13软件对表4结果进行多元回归拟合，得到回归方程：Y1=20.58+1.02A-0.0375B+0.02C+0.645AB-0.035AC+0.26BC-2.05A2-1.7B2-0.745 5C2。

由表5可知，该模型显著（P＜0.05），失拟项不显著（P＞0.05），说明该模型具有较强的统计学意义。由P值可知，一次项A，二次项A2、B2、C2对蛋白质溶出率的影响极显著（P＜0.01），交互项AB对蛋白溶出率影响显著（P＜0.05），其他项对蛋白质溶出率影响不显著（P＞0.05）。由F值可知，各因素对美味牛肝菌汤蛋白质溶出率影响的大小顺序为料液比（A）＞熬制温度（B）＞熬制时间（C）。

2.2.2 各因素间交互作用分析

采用Design-Expert 13软件绘制料液比与熬制温度间交互作用对蛋白质溶出率影响的响应面及等高线图见图4。

图4 料液比与熬制温度间交互作用对蛋白质溶出率影响的响应曲面及等高线Fig.4 Response surface plot and contour lines of effects of interaction between solid and liquid ratio and cooking temperature on protein dissolution rate

由图4可知，料液比和熬制温度间交互作用对美味牛肝菌汤蛋白质溶出率影响的响应面陡峭，等高线呈椭圆形，说明其对菌汤蛋白质溶出率的影响显著，与方差分析结果一致。

2.2.3 验证试验

采用Excel 2021对回归方程进行求解，得美味牛肝菌汤熬制的最佳工艺条件为料液比1∶73.69（g∶mL）、熬制温度68.76 ℃、熬制时间53.10 min，此条件下蛋白质溶出率预测值为20.10%。考虑实际操作，将试验条件调整为料液比1∶74（g∶mL）、熬制温度70 ℃、熬制时间50 min，在此条件下蛋白质溶出率实际值为20.12%，与理论值相差0.02%，说明该回归模型与实际试验过程匹配度高，可以有效地优化美味牛肝菌的熬制工艺。

2.3 美味牛肝菌汤冻干粉挥发性风味物质分析

采用HS-SPME-GC-MS对美味牛肝菌汤冻干粉的挥发性风味物质进行分析，结果见表6。

表6 美味牛肝菌汤冻干粉挥发性风味物质GC-MS分析结果Table 6 Results of volatile flavor components of Boletus edulis soup lyophilized powder analyzed by GC-MS

由表6可知，从美味牛肝菌汤冻干粉中共检测出29种挥发性风味物质，其中烃类4种、醇类1中、醛类4种、酮类5种、酸类1种、酯类2种、醚类1种、含硫化合物3种及含氮化合物8种。酮类化合物相对含量（31.66%）最高，其次为含氮化合物（26.46%）和酸类化合物（19.00%）。美味牛肝菌汤冻干粉中挥发性C8化合物和含硫化合物因含量丰富、识别阈值较低，且对食用菌的风味品质影响较大，被认为是食用菌中的特征挥发性风味物质[30]。在检测到的C8化合物中，苯乙醛是具有类似水果的香气[31]，相对含量为0.93%。含硫化合物主要有2-异丁基5-丙基噻吩（4.58%）、3-甲硫基丙醛（0.45%）和甲硫醇（0.36%）。吡嗪类化合物相对含量为1.67%，是羰基化合物与氨基化合物在一定条件下发生美拉德反应的产物[32]。

2.4 美味牛肝菌固体风味基料配方优化均匀试验

以美味牛肝菌汤冻干粉为基料，食盐（X1）、白砂糖（X2）、味精（X3）和柠檬酸（X4）为辅料，感官评分（Y2）为评价指标，通过均匀试验U9（95）优化配方，结果见表7，方差分析见表8。

表7 美味牛肝菌固体风味基料配方优化均匀试验设计及结果Table 7 Design and results of uniform tests for formula optimization of Boletus edulis solid flavor base material

表8 均匀试验结果的方差分析Table 8 Variance analysis of uniform tests results

采用Excel 2021对表7试验结果进行线性回归分析，得到食盐（X1）、白砂糖（X2）、味精（X3）、柠檬酸（X4）对感官评分（Y2）的线性回归方程：Y2=92.847+6.672X1-2.193X2+3.127X3-4.934X4。由表8可知，回归模型极显著（P＜0.01），表明建立的回归方程具有统计学意义。决定系数R2=0.996，调整决定系数R2Adj=0.986，说明该数学模型与试验结果拟合较好[33]。根据t检验可知，影响固体风味基料感官评价的因素主次顺序为X1＞X4＞X2＞X3。对回归方程求解得到美味牛肝菌固体风味基料的最优配方为：食盐4.5%、白砂糖3.0%、味精1.8%、柠檬酸0.1%，在此条件下预测得到的感官评分为93.13分。通过验证试验得固体风味基料感官评分为93.22分，与理论值相差0.09，制备得到的固体风味基料颜色成浅棕褐色，具有浓郁的美味牛肝菌风味，表明所建立的模型与试验结果具有较好的一致性，能够对固体风味基料配方进行优化。

3 结论

在单因素试验基础上，采用响应面法优化得到美味牛肝菌汤的最佳熬制工艺为料液比1∶74（mL∶g）、熬制温度70 ℃、熬制时间50 min，在此条件下的蛋白质溶出率达20.12%。通过HS-SPME/GC-MS鉴定美味牛肝菌汤冻干粉，共检出29种挥发性风味物质，酮类化合物（31.66%）、含氮化合物（26.46%）和酸类（19%）是相对含量最高的三类。以菌汤冻干粉为基料，采用均匀设计研制出美味牛肝菌固体风味基料的最佳配方为食盐4.5%、白砂糖3.0%、味精1.8%、柠檬酸0.1%，制备得到的固体风味基料颜色成浅棕褐色，具有浓郁的美味牛肝菌风味，感官评分为93.22分。本研究结果为美味牛肝菌深加工及风味调味料的研究奠定一定的理论基础，有着广阔的市场发展前景。