基于Nrf2/HO-1通路探讨七叶皂苷钠对脑缺血再灌注继发肺损伤的保护作用

许江飞，周海燕，王宽红

新乡市中心医院（新乡医学院第四临床学院）神经内科，新乡 453000

脑缺血为临床常见脑血管疾病之一，70%患者会发生脑缺血再灌注（cerebral ischemia-reperfusion，CIR）损伤，CIR损伤的死亡率达10%，致残率高于50%，再灌注不仅可造成脑组织缺血损伤，还会诱发远隔重要脏器（例如肺脏）损伤，这是造成患者死亡的重要原因之一［1］。核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1（nuclear factor E2-related factor 2/heme oxygenase-1，Nrf2/HO-1）属于内源性抗氧化通路，既往研究显示激活Nrf2/HO-1通路对脑出血、脑梗死等多种脑损伤均具有重要的保护作用［2-3］，也有基础研究证实激活Nrf2/HO-1通路可减轻内毒素诱发的急性肺损伤［4］。降低再灌注继发性脏器损伤为治疗CIR的重要环节，但目前尚缺乏明确疗效的靶向药物。七叶皂苷钠（sodium aescinate）是从七叶树科植物天师栗中提取的多酯键三萜皂苷钠盐，临床研究显示其能够缓解脑出血患者的脑水肿，降低出血量［5］，然而对CIR引发的肺损伤是否有保护作用目前尚不清楚。本研究采用七叶皂苷钠对CIR大鼠进行干预，探究其对CIR引发肺损伤的改善作用，初步探讨作用机制，以期为药物应用提供一定依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠74只，8～10周龄，体重200～220g，由北京科宇动物养殖中心提供，许可证号：SYXK（京）2018-0036。所有大鼠均在23℃、50%湿度环境中统一饲养，大鼠自由饮食饮水。本研究符合《实验动物管理条例》，且经动物伦理委员会批准（伦理批号：20201028）。

1.2 药品、试剂与仪器

1.2.1 药品与试剂

注射用七叶皂苷钠（武汉普生制药有限公司，国药准字H20057826，规格5mg，批号：180215）；Nrf2特异性抑制剂（ML385）（美国Selleck Chemicals公司，规格5mg，货号：846557-71-9）；水合氯醛、多聚甲醛购自德国Sigma-Aldrich公司，货号分别为C8383、P6148；生理盐水（江西江蓝纯生物试剂有限公司，货号：JLC-E1400）；HE染色试剂盒、RIPA裂解液均购自碧云天生物技术研究所，货号分别为C0105、P0013E；白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒均购自北京百奥莱博科技有限公司，货号分别为ZN2877-MBG、KFS230-AVD；活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）检测试剂盒、免疫组化试剂盒购自南京建成生物工程研究所，货号分别为E004-1-1、A003-1-2、A001-3-2、I001-1；Tris、甘氨酸、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、甲醇购自北京索莱宝生物科技有限公司，货号分别为T1160、T8190、S8010、M9330；过氧化氢溶液（北京万佳首化生物科技有限公司，货号：SH-00546）；柠檬酸钠（德国默克公司，货号：PHR1416）；兔抗鼠Nrf2、HO-1、抗氧化响应元件（antioxidant response element，ARE）抗体、核内参LaminB购自英国Abcam公司，货号分别为ab62352、ab137749、ab99975、ab16048；山羊抗兔HRP标记二抗、山羊抗鼠HRP标记二抗购自美国CST公司，货号分别为14708、96714；鼠抗鼠β-actin抗体（美国RcD公司，货号：MAB8929）。

1.2.2 仪器

Vi-Cell XR细胞计数仪（美国贝克曼公司）；FA3004电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；DHG-9023A烤箱（上海精宏实验设备有限公司）；Centrifuge 5702 RH离心机（德国Eppendorf公司）；JJ-2B匀浆器（上海达洛科学仪器有限公司）；XDS-200C倒置显微镜（蔡康光学仪器有限公司）；Mini-PROTEANTetra1658033垂直电泳仪、Mini-Trans Blot1703930转膜仪购于美国Bio-Rad公司；CUT4062石蜡切片机（德国SLEE公司）；Gel-Doc IT TS2凝胶成像仪（美国UVP公司）。

1.3 CIR大鼠模型建立

参照改良Zea-Longa线栓法构建CIR模型［6］。随机选取62只大鼠，经腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，在颈部正中部位做一切口，将左颈总动脉、左颈外动脉及左颈内动脉依次分离，于左颈外动脉远端用棉线环向缠绕1cm结扎。将栓线插入左颈总动脉，沿着左颈总动脉及左颈内动脉推送入大脑中动脉起始处，推入深度距离分叉部位2cm，阻断大脑中动脉血流，2h后将栓线从左颈总动脉缓慢抽出，使中动脉血流恢复（即缺血再灌注），24h后缝合颈部切口。大鼠清醒2h后，依据Zea Longa标准进行评分［7］，评分为1～3分者即认为造模成功，纳入研究。本研究的模型制备过程中共14只大鼠死亡，造模成功率为77.42%。

1.4 大鼠分组方法与给药处理

选取造模成功的48只大鼠，依据随机数字表法分为CIR模型（Model）组、七叶皂苷钠（SA）组、Nrf2抑制剂（ML385）组、七叶皂苷钠联合Nrf2抑制剂（SA+ML385）组，每组12只。另选取12只大鼠作为假手术（Sham）组，即不植入栓线，其他操作与Model组相同。

造模结束后，SA组给予注射用七叶皂苷钠，尾静脉注射，剂量为10mg/kg［8］；ML385组给予Nrf2特异性抑制剂（ML385），尾静脉注射，剂量为30mg/kg［9］；SA+ML385组尾静脉注射10mg/kg SA，15min后注射30mg/kg ML385；Sham、Model组尾静脉注射等体积生理盐水。各组均连续给药4周。

1.5 观察指标与检测方法

1.5.1 样本收集

末次给药处理后，将大鼠麻醉处死，左肺用1.8 mm气管插管行支气管肺泡灌洗，灌洗液用量为2.5ml/次，回收率80%，共灌洗5次，得到支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）；取右肺上叶组织，清洗后部分组织用4%多聚甲醛固定，部分组织用于制备肺组织匀浆液；右肺中叶组织用于评估肺的湿/干重比（wet/dry，W/D）；右肺下叶组织置于-80℃保存。

1.5.2 CIR大鼠肺组织病理形态学变化及肺组织病理损伤程度

取出4%多聚甲醛固定的肺组织，经脱水、透明、石蜡包埋后用切片机制备5μm肺组织石蜡切片，烘烤、脱蜡脱水后参照HE染色试剂盒说明书对肺组织切片进行染色，封片后置于倒置显微镜下观察并保存病理形态学图片。采用半定量法［10］评估肺组织病理损伤程度，评价项目包括肺泡充血、炎症细胞浸润、间质水肿、肺泡水肿及肺泡壁厚度，每个项目0～4分，共20分，评分越高代表损伤越严重。

1.5.3 CIR大鼠肺组织的干重、湿重

采用电子天平称取右肺中叶组织的重量，记录湿重（wet，W）；将右肺中叶组织置于80℃烤箱中，当两次测量重量差不超过0.2mg时即为恒重，记录干重（dry，D）；计算肺组织的W/D值。

1.5.4 CIR大鼠BALF中的炎症因子水平与炎症细胞计数

将BALF在4℃、3000r/min的条件下离心10min后，保留上清液，采用ELISA法检测BALF上清液中TNF-α、IL-1β水平（参照相关试剂盒说明书进行操作）；采用全自动细胞计数仪测定BALF原液中总细胞数、多形核白细胞数量。

1.5.5 CIR大 鼠 肺 组 织 中 的SOD、MDA、ROS水平

称取1mg肺组织，添加9ml生理盐水，研磨后置于匀浆器中制备匀浆液。采用硫代巴比妥酸法检测MDA水平；采用氮蓝四唑光还原法检测组织SOD水平；采用二氢乙锭（dihydroethidium，DHE）法［11］检测肺组织中ROS相对水平。

1.5.6 免疫 印 迹（Western blotting，WB）法测定CIR大鼠肺组织Nrf2、ARE、HO-1蛋白表达水平

实验开始前先进行配液：①电泳缓冲液（5×）配制：Tris 15.1g，甘氨酸72.0g，SDS 5.0g，蒸馏水定容至1L，pH调至8.3，制得电泳缓冲液（5×），置于4℃保存。使用时将电泳缓冲液（5×）稀释为电泳缓冲液（1×），即：取200ml电泳缓冲液（5×），蒸馏水定容至1L，即得。②转膜缓冲液配制：甘氨酸2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，600ml蒸馏水充分溶解，加200ml甲醇后混匀，定容至1L，现配现用。

配液完成后，取-80℃保存的右肺下叶组织，加入RIPA裂解液裂解，冰浴匀浆后，4℃12000r/min离心20min，上清液即为蛋白样本。测定蛋白含量后，取20μg蛋白行10% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）电泳，将凝胶转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，用山羊血清封闭膜，清洗后用Nrf2、ARE、LaminB、HO-1、β-actin一抗（1∶300）孵育，4℃过夜。洗涤后于37℃下用山羊抗兔HRP标记二抗或山羊抗鼠HRP标记二抗（1∶3000）孵育2h。经增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）显色后，在凝胶成像仪中观察成像情况，以鼠抗鼠β-actin抗体为内参蛋白，采用ImageJ 1.8.0软件对蛋白相对表达情况进行分析。

1.5.7 免疫组化法检测CIR大鼠肺组织Nrf2、ARE、HO-1阳性表达情况

肺组织石蜡切片经脱蜡水化后加入过氧化氢溶液，浸泡10min以消除内源性过氧化酶，清洗后加入柠檬酸钠进行抗原热修复，滴加山羊血清后室温下封闭20min，用兔抗鼠Nrf2、ARE、HO-1一抗及鼠抗鼠β-actin一抗（1∶300）于4℃孵育，过夜，用山羊抗兔HRP标记二抗或山羊抗鼠HRP标记二抗（1∶3000）室温下孵育45min，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色后行苏木精复染、氨水反蓝，经脱水、透明、封片后进行镜检，利用ImageJ 1.8.0软件分析Nrf2、ARE、HO-1阳性表达率，蛋白阳性表达率=视野下阳性染色细胞数/细胞总数×100%。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资料以±s表示，多组间比较行单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 CIR大鼠肺组织病理形态学变化及肺组织病理损伤程度

Model组、ML385组肺组织中肺血管及肺泡隔膜毛细血管扩张，肺泡壁变厚，肺泡腔变窄，肺泡隔变宽，伴有炎症细胞浸润，肺间质出现水肿、充血；与Model组比较，SA组、SA+ML385组均明显改善。各组大鼠肺组织HE染色结果见图1。

图1 各组大鼠肺组织HE染色结果（100×）

与Sham组比较，Model组肺损伤评分升高（P＜0.05），证明CIR模型构建成功。ML385组肺损伤评分高于Model组（P＜0.05）。SA组、SA+ML385组肺损伤评分低于Model组，且SA+ML385组肺损伤评分高于SA组、低于ML385组（P＜0.05）。各组大鼠肺损伤评分趋势见图2。

2.2 CIR大鼠肺组织的W/D

与Sham组比较，Model组肺组织的W/D值升高（P＜0.05）。ML385组肺组织的W/D值高于Model组（P＜0.05）。SA组、SA+ML385组肺组织的W/D值低于Model组，且SA+ML385组肺组织的W/D值高于SA组、低于ML385组（P＜0.05）。各组大鼠肺组织的W/D趋势见图3。

图3 各组肺组织的W/D值比较（n=12）

2.3 CIR大鼠BALF中的炎症因子水平与炎症细胞计数

与Sham组比较，Model组BALF中IL-1β、TNF-α、总细胞数量、多形核白细胞数量均升高（P＜0.05）。ML385组BALF中各指标均高于Model组（P＜0.05）。SA组、SA+ML385组BALF中各指标均低于Model组，且除TNF-α外，SA+ML385组BALF中各指标高于SA组、低于ML385组（P＜0.05）。各组BALF中的IL-1β、TNF-α、总细胞数量、多形核白细胞数量趋势见图4。

图4 各组IL-1β、TNF-α、总细胞数量、多形核白细胞数量比较（n=12）

2.4 CIR大鼠肺组织中的SOD、MDA、ROS水平

与Sham组比较，Model组ROS、MDA水平均升高，SOD水平降低（P＜0.05）。ML385组ROS、MDA水平高于Model组，SOD水平低于Model组（P＜0.05）。SA组和SA+ML385组ROS、MDA水平低于Model组，SOD水平高于Model组；SA+ML385组ROS、MDA水平高于SA组，SOD水平低于SA组、高于ML385组（P＜0.05）。各组ROS、MDA、SOD水平趋势见图5。

图5 各组ROS、MDA、SOD水平比较（n=12）

2.5 CIR大鼠肺组织Nrf2、ARE、HO-1蛋白表达

与Sham组比较，Model组肺组织Nrf2、ARE、HO-1蛋白表达降低（P＜0.05）。ML385组Nrf2、ARE、HO-1蛋白表达低于Model组（P＜0.05）。SA组 和SA+ML385组Nrf2、ARE、HO-1蛋白表达高于Model组；SA+ML385组Nrf2、ARE、HO-1蛋白表达低于SA组、高于ML385组（P＜0.05），各组Nrf2、ARE、HO-1蛋白表达量趋势见图6。

图6 各组肺组织Nrf2、ARE、HO-1蛋白表达水平变化（n=12）

2.6 CIR大鼠肺组织Nrf2、ARE、HO-1阳性表达情况

与Sham组比较，Model组肺组织Nrf2、ARE、HO-1阳性表达降低（P＜0.05）。ML385组Nrf2、ARE、HO-1阳性表达低于Model组（P＜0.05）。SA组 和SA+ML385组Nrf2、ARE、HO-1阳性表达高于Model组；SA+ML385组Nrf2、ARE、HO-1阳性表达低于SA组、高于ML385组（P＜0.05）。各 组Nrf2、ARE、HO-1蛋白阳性表达见图7。

图7 各组Nrf2、ARE、HO-1蛋白阳性表达比较（n=12）

3 讨论

本研究采用改良Zea-Longa线栓法［6］构建CIR致肺损伤大鼠模型，结果发现Model组肺组织出现肺泡壁变厚，肺泡腔变窄，肺泡隔变宽，伴有炎症细胞浸润，且伴有肺间质水肿、充血，大鼠肺组织的W/D值升高，以上结果说明Model组大鼠肺组织发生严重炎症性损伤及病理改变，符合肺损伤大鼠模型特征，提示造模成功。

七叶皂苷钠是从中药天师栗果实中提取的重要活性成份，药理学研究结果提示其具有修复毛细血管通透性、消肿、抗炎等功效［12］，有临床研究表明七叶皂苷钠在治疗脑出血、脑水肿方面疗效较佳［13］。七叶皂苷钠可通过调控缺氧诱导因子-1α发挥对心肺复苏后大鼠脑组织的保护作用［14］，但其对CIR致脑损伤的治疗作用尚不明确。本研究发现经七叶皂苷钠干预后，大鼠肺组织病理学得到明显改善，肺组织评分降低，肺组织的W/D值降低，提示七叶皂苷钠可以缓解CIR所致大鼠肺组织水肿，缓解肺组织的炎症反应。

肺组织中的肺泡巨噬细胞能够释放大量的IL-1β、TNF-α等促炎性细胞因子，进一步扩大炎症反应。此外IL-1β、TNF-α水平升高能够加速中性粒细胞浸润至肺组织损伤区，扩大组织炎症反应，造成恶性循环［15］。基础研究显示，抑制IL-1β分泌可缓解大鼠肺损伤［16］。本研究发现，Model组肺组织BALF中IL-1β、TNF-α、总细胞数量、多形核白细胞数量均升高，经七叶皂苷钠干预后各指标均降低，提示七叶皂苷钠可能通过抑制肺组织炎症因子释放而降低炎症反应，缓解肺组织损伤。

Nrf2为细胞核转录因子，一般与Keap1结合并存在于细胞质内，当受到氧化应激刺激后，Nrf2与Keap1解离，移位到细胞核中与ARE蛋白结合调控下游HO-1等抗氧化酶，发挥抗氧化作用［17］。Nrf2/HO-1与脑组织氧化损伤有关，过往研究显示激活Nrf2/HO-1通路有利于降低脑组织的氧化应激反应，发挥脑损伤的神经保护作用［18］。Li等［19］发现淫羊藿苷Ⅱ可通过激活Nrf2/HO-1通路而减轻脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织氧化应激水平；Cattani等［20］发现激活Nrf2/HO-1可减弱小鼠肺组织氧化应激、减弱NF-κB/TNF-α途径而降低炎症反应。然而Nrf2/HO-1与CIR继发肺损伤的关系目前尚不明确。本研究中，Model组大鼠肺组织中Nrf2、ARE、HO-1表达水平降低，提示CIR继发肺损伤发生可能与Nrf2/HO-1信号通路的抑制有关。经七叶皂苷钠干预后，大鼠肺组织中Nrf2、ARE、HO-1表达水平升高，推测七叶皂苷钠缓解CIR大鼠肺部炎症反应的作用可能与Nrf2/HO-1信号通路的激活有关。脑损伤或脑出血后，脑组织中会释放大量ROS，造成氧自由基增多，并进一步导致SOD减少，MDA 等氧化物质增多，加重氧化应激损伤［21］。本研究中，Model组MDA、ROS水平均升高，SOD水平降低；经七叶皂苷钠干预后，MDA、ROS水平均降低，SOD水平升高，提示七叶皂苷钠可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路降低CIR引发的氧自由基堆积，发挥抗氧化作用。为证实这一推测，本研究采用Nrf2特异性抑制剂处理CIR大鼠发现，经Nrf2特异性抑制剂干预后，CIR大鼠肺组织损伤更为严重，BALF中炎症因子表达水平及炎症细胞数量均高于Model组，肺组织中Nrf2、ARE、HO-1表达水平均低于Model组，提示抑制Nrf2表达后能够加重CIR后肺组织炎症反应及氧化应激水平，加重肺损伤；Nrf2特异性抑制剂联合七叶皂苷钠干预后发现，大鼠肺部炎症反应、肺损伤得到一定缓解，进一步说明七叶皂苷钠能够通过激活Nrf2/HO-1信号通路，降低CIR后肺组织炎症反应及氧化应激水平，改善肺组织损伤。

综上所述，七叶皂苷钠可在一定程度上改善CIR继发肺损伤，其机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路、降低CIR后肺组织炎症反应及氧化应激水平有关。本研究也存在一定的缺陷，例如CIR继发肺损伤发生机制较为复杂，七叶皂苷钠是否还可能通过参与其他信号通路对CIR继发肺损伤的保护作用还有待后续深入探究。