X射线与γ射线辐照对悬浮红细胞质量影响的对比研究

冯娜 兰静 曹鑫 丁谨 景媛媛

陕西省血液中心，西安 710061

辐照血液主要是指对血液制剂使用一定剂量的γ或X射线进行照射，使血液中的淋巴细胞失去活性所制成的全血或成分血[1-2]，在临床上主要用于预防输血相关性移植物抗宿主病（transfusion associated graft versus host diseases，TA-GVHD）的发生[3-4]。目前国内外主要应用γ射线辐照技术制备辐照血液，有的国家应用率已高达95%[5]。作为国际公认的用于制备辐照血液的推荐方法之一，X射线辐照技术因其辐射均匀性好、易于安全防护、不易造成环境污染等优点正逐渐替代γ射线辐照技术被应用于制备辐照血液[6]。然而，现有法律法规对X射线辐照血液的质量标准仍无明确规定，并且X射线对红细胞质量的影响还有待深入探究。基于此，本研究通过测定X射线辐照仪制备的辐照血液与γ射线辐照仪制备的辐照血液在不同保存期的质控指标与部分理化指标，对比分析两种技术制备的辐照血液的差异，以评价X射线辐照仪制备的辐照血液的质量，同时为后续建立辐照血液的具体质量标准提供数据支持，具体报告如下。

材料与方法

1 研究对象

随机抽取ALT检测不合格，其他各项检测均合格的2 U悬浮红细胞共计49袋，其中21袋进行γ射线辐照，28袋进行X射线辐照。本研究所涉及的悬浮红细胞样本均来源于初筛合格的无偿献血者。

2 主要仪器及试剂

γ射线血液辐照仪（BIOBEAM 8000，德国）与X射线血液辐照仪（RS3400，山东威高）分别用于悬浮红细胞的辐照处理；悬浮红细胞血细胞比容（HCT）与血红蛋白含量（cHb）的测定使用血细胞计数仪（KX-21，Sysmex）完成；使用生化分析仪（008a，日立）完成红细胞上清液中K+、Na+、Cl-、Ca2+的测定；K+、Na+、Cl-浓度测定所使用的试剂包括参比电极液（日立，批号：L1656）、样本稀释液（日立，批号：K2321）、内部标准液（日立，批号：J4801）；钙离子检测试剂盒（和光，批号：205877）用于Ca2+浓度的测定；恒温水浴箱（BWS-20，上海一恒）、紫外可见分光光度计（T6，北京普析）与游离血红蛋白测定试剂盒（瑞尔达，北京）用于游离血红蛋白含量的测定。

3 悬浮红细胞标本的留取和保存

实验所涉及的悬浮红细胞均严格按照《血站技术操作规程》与《全血及成分血质量要求》的要求制备而来，除ALT检测不合格以外，其他各项检测均合格。将留取的49袋悬浮红细胞全部置于2～6℃血液冷藏冰箱中保存。

4 对悬浮红细胞进行X射线辐照与γ射线辐照

将留取的悬浮红细胞按照辐照技术的不同分为X组与γ组，其中X组共计28袋悬浮红细胞，γ组共计21袋悬浮红细胞。为了最大限度考察辐照血液各项指标的变化，在采集后第13天对X组与γ组悬浮红细胞分别进行X射线与γ射线辐照处理，辐照结束后将血液置于2～6 ℃血液冷藏冰箱中保存备用。

5 取样时间点的选择

根据GB 18469-2012的规定，经辐照后的血液制剂，其质量控制要求与原血液制剂的要求相同，故本项目共设计了两个取样时间点，分别为辐照后第1天与辐照后第22天，即采集后第14天与采集后第35天。

6 血细胞比容（HCT）与血红蛋白含量（c血红蛋白）的测定

分别留取采集后第14天（辐照后第1天）与采集后第35天（辐照后第22天）的经X射线与γ射线辐照后的悬浮红细胞，使用血细胞计数仪测定其血细胞比容与血红蛋白含量。

7 游离血红蛋白含量（c游离血红蛋白）的测定

分别留取采集后第14天（辐照后第1天）与采集后第35天（辐照后第22天）的经X射线与γ射线辐照后的悬浮红细胞，通过低速离心机以3 500×g离心5 min后取上清液，使用游离血红蛋白测定试剂盒进行游离血红蛋白含量的测定，具体操作步骤参照游离血红蛋白测定试剂盒说明书。

8 溶血率的计算

根据公式溶血率（%）=（1-HCT）×c游离血红蛋白/c血红蛋白×100%计算相应时间点的溶血率。

9 K+、Na+、Cl-、Ca2+浓度的测定

分别留取采集后第14天（辐照后第1天）与采集后第35天（辐照后第22天）的经X射线与γ射线辐照后的悬浮红细胞，通过低速离心机以3 500×g离心5 min后取上清液，使用日立008a全自动生化分析仪及相应试剂分别测定上清液中的K+、Na+、Cl-、Ca2+浓度。

10 统计学分析

SPSS 22.0数据分析软件用于实验数据的统计分析。计算各组数据的平均值与标准差，采用平均值±标准差（）对实验结果进行表示，其中溶血率的单位为%，K+、Na+、Cl-、Ca2+浓度的单位均为mmol/L。两组数据间的差异性比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 溶血率的比较

结果见表1。辐照后第1天，X组的溶血率为（0.10±0.03）%，γ组的溶血率为（0.09±0.06）%，两者无显著性差异（P1，2＞0.05）。辐照后第22天，X组的溶血率为（0.29±0.07）%，γ组的溶血率为（0.27±0.06）%，两者无明显差异（P3，4＞ 0.05）。随着保存时间的延长，X组与γ组的溶血率均明显增大（P1，3＜0.05，P2，4＜0.05），但均满足红细胞制剂储存期末溶血率＜红细胞总量的0.8%的质量标准。

表1 X组与γ组溶血率的对比

2 K+浓度的比较

见表2。辐照后第1天，X组上清液K+浓度为（46.50±7.94）mmol/L，γ组上清液K+浓度为（45.03±4.65）mmol/L，X组上清液K+浓度与γ组上清液K+浓度相当（P1，2＞0.05）。辐照后第22天，X组上清液K+浓度为（64.22±4.58）mmol/L，γ组上清液K+浓度为（63.05±3.57）mmol/L，两者无明显差异（P3，4＞0.05）。X组上清液与γ组上清液中的K+浓度随着保存时间的延长明显增大（P1，3＜0.05，P2，4＜0.05）。

表2 X组与γ组上清液中K+浓度的对比

3 Na+浓度的比较

结果见表3。辐照后第1天，X组上清液Na+浓度为（99.44±3.86）mmol/L，γ组上清液Na+浓度为（100.83±4.79）mmol/L，X组上清液Na+浓度与γ组Na+浓度无明显差异（P1，2＞0.05）。辐照后第22天，X组上清液Na+浓度为（81.50±5.56）mmol/L，γ组上清液Na+浓度为（81.76±3.91）mmol/L，两者无明显差异（P3，4＞0.05）。随着保存时间的延长，X组上清液与γ组上清液中的Na+浓度均明显降低（P1，3＜0.05，P2，4＜0.05）。

表3 X组与γ组上清液中Na+浓度的对比

4 Cl-浓度的比较

结果如表4所示。辐照后第1天，X组上清液中的Cl-浓度为（68.35±2.79）mmol/L，γ组上清液中的Cl-浓度为（67.59±1.26）mmol/L，X组上清液中的Cl-浓度与γ组上清液中的Cl-浓度无明显差异（P1，2＞0.05）。辐照后第22天，X组Cl-的浓度为（68.72±1.97）mmol/L，γ组Cl-的浓度为（68.28±1.36）mmol/L，两者无明显差异（P3，4＞0.05）。随着保存时间的延长，X组与γ组上清液中的Cl-浓度均无明显变化（P1，3＞0.05，P2，4＞0.05）。

表4 X组与γ组上清液中Cl-浓度的对比

5 Ca2+浓度的比较

结果如表5所示。辐照后第1天，X组上清液中的Ca2+浓度为（0.40±0.11）mmol/L，γ组上清液中的Ca2+浓度为（0.43±0.08）mmol/L，X组上清液中的Ca2+浓度与γ组上清液中的Ca2+浓度无明显差异（P1，2= 0.192）。辐照后第22天，X组上清液中的Ca2+浓度为（0.39±0.10）mmol/L，γ组上清液中的Ca2+浓度为（0.41±0.04）mmol/L，两者无明显差异（P3，4=0.613）。且随着保存期的延长，X组与γ组上清液中的Ca2+浓度无明显变化（P1，3＞0.05，P2，4＞0.05）。

表5 X组与γ组的Ca2+浓度对比

讨 论

TA-GVHD是输血最严重的并发症之一，其发病机制主要是由于受者机体的免疫系统无法正常识别并清除供者的外源细胞，供者的淋巴细胞在受者体内存活并定植，通过识别受者宿主抗原、介导免疫反应攻击宿主的靶器官及组织[3-4]。输注辐照血液是最常用，也是最有效的用于预防TA-GVHD的方法[7]。

目前用于制备辐照血液的技术主要为γ射线辐照技术与X射线辐照技术。γ射线辐照通常采用放射性同位素钴60（60Co）或铯137（137Cs）作为永久放射源[8-10]，目前在国内采供血机构已经得到了广泛应用[11-14]。X射线辐照则是利用电子加速器产生的高能电子轰击靶点发生韧致辐射反应而产生X射线进行辐照[9]，待使用状态时对环境和使用人员无安全威胁，国内关于X射线辐照仪的创新研究已逐渐增多[15-17]。有研究表明，随着保存时间的延长，经辐照后的红细胞成分包括携氧能力、细胞活性、渗透脆性、上清液K+浓度、Na+浓度、游离血红蛋白在内的诸多理化指标会产生变化，辐照会导致红细胞一定程度的损伤[18]，因此，对辐照后红细胞成分质量的变化进行探究具有重要意义。经查阅文献资料，目前已有较多对γ射线辐照对血液制剂质量的影响的文献报道[19-22]，而有关于X射线辐照对血液制剂质量影响的研究则较少[23-25]。此外，《全血及成分血质量要求》（GB-18469）也仅对γ射线辐照血液的质量要求进行了规定，而未涉及X射线辐照血液[26]。

本研究对X射线辐照仪与γ射线辐照仪制备的辐照红细胞成分在辐照后第1天与辐照后第22天的溶血率、上清液K+浓度、Na+浓度、Cl-浓度与Ca2+浓度进行了测定，并对比分析了两种技术制备的辐照红细胞成分相关指标的差异，以评价X射线对辐照红细胞成分质量的影响，并为辐照红细胞成分质量标准的建立和细化提供数据支持。实验结果显示，经X射线辐照仪与γ射线辐照仪制备的辐照红细胞成分在辐照后第1天与辐照后第22天的溶血率、上清液K+浓度、Na+浓度、Cl-浓度与Ca2+浓度均无明显差异（P＞0.05），提示X射线辐照与γ射线辐照对红细胞成分质量的影响相当，与现有的文献报道结果一致[24，27]，认为γ射线辐照仪制备的辐照血液的质量标准应适用于X射线辐照仪制备的辐照血液。另外，随着辐照后保存时间的延长，两种技术制备的辐照红细胞成分的溶血率、上清液K+浓度均明显增大，这是因为随着保存时间的延长，红细胞膜逐渐出现破裂，红细胞中的血红蛋白与K+释放到红细胞外所致，上清液K+浓度的增大提示对于血钾偏高的患者，应尽量使用较新鲜的辐照红细胞成分，或者在输注辐照红细胞成分后应及时应用降血钾药物，以避免引起不良后果[28-30]。另外，当保存期为辐照后第22天，即采集后第35天时，两种技术制备的辐照红细胞成分的溶血率，均满足红细胞制剂储存期末溶血率＜红细胞总量的0.8%的质量标准，但考虑到本文仅考察了《全血及成分血质量要求》规定的质控指标，未涉及诸如2，3-DPG、ATP、红细胞渗透脆性等其他反映红细胞状态的指标，因此，是否可考虑将辐照红细胞成分的保存期进行适当延长，需依据其他指标的探究结果进行综合判定。与溶血率、上清液K+浓度变化不同的是，两种技术制备的辐照红细胞成分的上清液Na+浓度均随着辐照后保存时间的延长显著降低，而上清液Cl-浓度与Ca2+浓度则不随辐照后保存期的延长而发生变化。

综上，X射线辐照仪与γ射线辐照仪制备的辐照红细胞成分的质量无明显差异，表明使用X射线辐照仪替代γ射线辐照仪是安全、可行的。但通过调研文献资料发现，辐照血液与未辐照血液的各项指标相比均有不同程度的差异[30-31]，提示X射线辐照对血液成分也可能存在一定程度的损伤，后续我们也将继续开展X射线辐照血液的相关研究，以为辐照血液质量标准的优化和完善提供更加详实的数据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突