吴茱萸碱通过调节HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路减轻大鼠输血相关性急性肺损伤*

乔剑 刁春红 于洋 张娜 常梦远

联勤保障部队第九八三医院输血医学科，天津 300142

输血相关性急性肺损伤（transfusion-related acute lung injury，TRALI）是一种输血诱发的并发症，具有起病快、进展迅速、致死率高的特点[1-2]。输血过程中内皮细胞和嗜中性粒细胞激活诱发的肺微血管系统炎症反应是TRALI的重要病理基础[3]。高迁移率族蛋白Bl（high-mobility group box 1，HMGBl）/Toll样受体4（Toll- like receptor 4，TLR4）/核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）通路可通过介导炎症反应参与肾脏、肺脏等器官损伤[4-5]。据报道，降低HMGB1可减轻输血诱导的内皮细胞坏死和组织器官损伤[6]；而激活NF-κB信号可加重小鼠TRALI症状[7]。吴茱萸碱具有抗炎、免疫调节和抗菌等功效[8]。研究显示，吴茱萸碱是急性肺损伤等炎症性疾病的潜在治疗剂[9-10]；且吴茱萸碱可通过抑制HMGB1/NF-κB/TLR4通路，减轻哮喘大鼠气道炎症和肺损伤[11]。本实验旨在探究吴茱萸碱对TRALI大鼠肺损伤的影响及机制。

材料与方法

1 材料

1.1 实验动物

72只健康SD大鼠，雄性，SPF级，体质量（220±20）g，7周龄，采购于上海吉辉实验动物饲养有限公司，生产许可证号SCXK（沪）2022-0009。于维持屏障环境且温度设为（23±2）℃、湿度设为（60±5）%动物房内饲养大鼠，并每天以12 h黑暗/12 h光照的节律交替照明。将大鼠适应性饲养7 d后进行实验。本研究经本院伦理委员会审核通过，批号：医伦审〔2022〕57号。

1.2 试剂与仪器

吴茱萸碱（纯度≥98%，批号W012140801）采购自成都瑞芬思生物科技有限公司；HMGB1过表达质粒、空载质粒采购自山东维真生物科技有限公司；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）（批号113M4068V）、吉姆萨染液、DAPI染液采购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；大鼠肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白细胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒、苏木素-伊红（haematoxylin eosin，HE）染色试剂盒采购自北京索莱宝科技有限公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记山羊抗小鼠IgG二抗、小鼠抗大鼠β-actin、TLR4、Ly6g、CD41a、p-NF-κB p65、HMGB1及NF-κB p65一抗、Alexa Fluor® 488标记山羊抗小鼠IgG二抗、Alexa Fluor® 647标记山羊抗小鼠IgG二抗采购自美国Abcam公司。

FinePointe WBP无创肺功能检测系统采购自DSI Buxco公司（美国）；3000A冷冻切片机采购自达科为（深圳）医疗设备有限公司；P250 FLASH荧光显微镜采购自济南丹吉尔电子有限公司；SynergyH1酶标检测仪采购自BioTek公司（美国）；VE小型蛋白垂直电泳与印迹系统采购自Cytiva公司（美国）。

2 方法

2.1 制备TRALI大鼠模型并分组给药

取SD大鼠随机分为对照组、模型组、吴茱萸碱低剂量组、吴茱萸碱高剂量组、空载组、吴茱萸碱高剂量+HMGB1过表达组，每组12只，除对照组外的其余各组大鼠参照文献[12]制备TRALI大鼠模型：以2 mg/kg的剂量腹腔注射LPS，2 h后腹腔注射45 mg/kg戊巴比妥钠进行麻醉，于股血管处插管抽出1 mL血液（约等于大鼠10%血容量）后输注1 mL人血浆（速度为4 mL/h，血型为AB型）即完成造模，对照组大鼠腹腔注射等剂量生理盐水后抽出血液后输注1 mL生理盐水。

大鼠于造模前3 d开始分组处理，造模当天于造模前30 min进行处理，共处理7 d，具体处理方案如下：吴茱萸碱低剂量组、吴茱萸碱高剂量组大鼠分别灌胃40、80 mg/kg吴茱萸碱（吴茱萸碱用0.5%的羧甲基纤维素钠制备成混悬液，分别以10 mL/kg的剂量灌胃4、8 mg/mL吴茱萸碱混悬液，1次/d，吴茱萸碱的给药剂量由参考文献[13]和预实验结果确定），同时尾静脉注射与吴茱萸碱高剂量+HMGB1过表达组等剂量的生理盐水（1次/3 d）；空载组大鼠灌胃10 mL/kg的0.5%羧甲基纤维素钠（1次/d），同时尾静脉注射空载质粒（溶于生理盐水，剂量遵照说明指导，1次/3 d）；吴茱萸碱高剂量+HMGB1过表达组大鼠灌胃80 mg/kg吴茱萸碱（以10 mL/kg的剂量灌胃8 mg/mL吴茱萸碱混悬液，1次/d），同时尾静脉注射HMGB1过表达质粒（溶于生理盐水，剂量遵照说明指导，1次/3 d）；对照组、模型组大鼠灌胃10 mL/kg的0.5%羧甲基纤维素钠（1次/d），同时尾静脉注射与吴茱萸碱高剂量+HMGB1过表达组等剂量的生理盐水（1次/3 d）。

2.2 检测各组大鼠肺功能

最后1次给药24 h后以无创肺功能检测系统检测各组大鼠每分钟通气量（minute ventilation，MV）、呼气峰流速（peak expiratory flow，PEF）、吸气阻力（resistance inspiratory，Ri），以此评估其肺功能。

2.3 检测各组大鼠BALF中细胞总数与中性粒细胞百分比、肺湿干比并采集标本

肺功能检测结束后麻醉各组大鼠，开胸采集其腹主动脉血，离心得到血清样本，存在-80℃备用；各组大鼠做气管插管，同时结扎其右主支气管，以1 mL生理盐水缓慢灌洗左肺，回抽灌洗液再次灌洗，如此重复3次后离心灌洗液得肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）存在-80℃备用；剩下的细胞沉淀以PBS缓冲液混匀，于细胞计数板中滴加20 μL，行吉姆萨染色，于显微镜下观察并计数其中细胞总数与中性粒细胞数，计算中性粒细胞百分比=中性粒细胞数/细胞总数×100%。

得到BALF后每组随机选出6只大鼠取其双肺，称量右肺湿重（W1），然后将其置于80℃烘箱中烘干，称重其干重（W2），计算肺湿干比=W1/W2。

每组剩余的6只大鼠取其双肺，自右肺上剪下约0.5 g肺组织，以RIPA缓冲液提取各组蛋白后以BCA法测定其浓度，存在-80℃备用；剩余右肺组织包埋后速冻成块，以在冷冻切片机切片，以预冷4%多聚甲醛固定30 min后存在-20℃备用。

2.4 HE染色检测各组大鼠肺组织病理形态并进行病理评分

取2.3中各组大鼠肺组织冷冻切片以预冷蒸馏水漂洗，行HE染色，于显微镜下观察并任选6个视野采集图像，根据Holfbauer评分[14]进行病理评分，分值越大表示损伤约严重，最大为4分。

2.5 免疫荧光染色检测各组大鼠肺组织内血小板与中性粒细胞聚集情况

取2.3中的各组大鼠肺组织冷冻切片以预冷蒸馏水漂洗、血清封闭、抗原修复、分别孵育小鼠抗大鼠Ly6g、CD41a一抗（每种抗体孵育3张切片）、TBST漂洗、孵育相应的荧光标记二抗，洗片后封片观察，于荧光显微镜下采集任意6个视野图像，用Image-J图像分析系统定量图像中绿色和红色荧光强度，取6个视野平均值可得切片中血小板-中性粒细胞合光密度。

2.6 ELISA法检测各组大鼠BALF及血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平

取2.3中的各组大鼠血清及BALF解冻后采用ELISA检测试盒分别测定其中TNF-α、IL-1β水平。

2.7 免疫印迹检测各组大鼠肺组织HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路相关蛋白表达

取2.3中的各组大鼠肺组织蛋白样品液解冻后每组取20 μg蛋白样本，于120V恒压下进行电泳后湿转，剪下待测蛋白HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65和内参蛋白β-actin条带，封闭其非特异位点后行抗原抗体反应，化学发光显色后摄取图像，用Image-J图像分析系统定量各组蛋白灰度值后计算其相对表达，公式：相对表达=待测蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

3 统计学处理

结 果

1 吴茱萸碱对各组大鼠肺功能的影响

与对照组相比，模型组大鼠肺功能指标MV、PEF显著降低（P＜0.05），Ri显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，吴茱萸碱低剂量组、吴茱萸碱高剂量组大鼠肺功能指标MV、PEF均升高（P＜0.05），Ri均降低（P＜0.05），空载组大鼠肺功能指标MV、PEF、Ri无明显变化（P＞0.05）；与吴茱萸碱低剂量组相比，吴茱萸碱高剂量组大鼠肺功能指标MV、PEF升高（P＜0.05），Ri降低（P＜0.05）。与吴茱萸碱高剂量组相比，吴茱萸碱高剂量+HMGB1过表达组大鼠肺功能指标MV、PEF降低（P＜0.05），Ri升高（P＜0.05）。各组大鼠肺功能指标MV、Ri、PEF差异比较均有统计学意义（F=16.348、21.521、19.341，P＜0.001），见图1。

图1 各组大鼠肺功能指标MV、Ri、PEF比较

2 吴茱萸碱对各组大鼠BALF中细胞总数与中性粒细胞百分比的影响

与对照组相比，模型组大鼠BALF中细胞总数和中性粒细胞百分比显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，吴茱萸碱低剂量组、吴茱萸碱高剂量组大鼠BALF中细胞总数和中性粒细胞百分比均降低（P＜0.05），空载组大鼠BALF中细胞总数和中性粒细胞百分比无明显变化（P＞0.05）；与吴茱萸碱低剂量组相比，吴茱萸碱高剂量组大鼠BALF中细胞总数和中性粒细胞百分比降低（P＜0.05）；与吴茱萸碱高剂量组相比，吴茱萸碱高剂量+HMGB1过表达组大鼠BALF中细胞总数和中性粒细胞百分比升高（P＜0.05）。各组大鼠BALF细胞总数和中性粒细胞百分比差异比较均有统计学意义（F=13.412、17.943，P＜0.001），见图2。

图2 各组大鼠BALF细胞总数和中性粒细胞百分比的比较

3 吴茱萸碱对各组大鼠肺水肿及肺组织病理形态的影响

对照组大鼠肺泡结构清晰正常，肺组织无水肿炎症、细胞浸润、充血等病理损伤症状。模型组大鼠肺泡壁增厚且其间隔加宽，肺组织内有大量炎性细胞浸润并产生出血、水肿等病理损伤症状，与对照组相比，大鼠肺湿干比和肺组织病理评分显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，吴茱萸碱低剂量组、吴茱萸碱高剂量组大鼠肺组织上述病理损伤症状均减轻，肺湿干比和肺组织病理评分均降低（P＜0.05）；空载组大鼠肺组织上述病理损伤症状未见减轻，肺湿干比和肺组织病理评分无明显变化（P＞0.05）；与吴茱萸碱低剂量组相比，吴茱萸碱高剂量组大鼠肺组织上述病理损伤症状减轻，肺湿干比和肺组织病理评分降低（P＜0.05）。与吴茱萸碱高剂量组相比，吴茱萸碱高剂量+HMGB1过表达组大鼠肺组织上述病理损伤症状加重，肺湿干比和肺组织病理评分升高（P＜0.05）。各组大鼠肺湿干比和肺组织病理评分差异比较均有统计学意义（F=12.250、18.439，P＜0.001），见图3、图4。

图3 HE染色检测各组大鼠肺组织病理形态（×200）

图4 各组大鼠肺湿干比和肺组织病理评分比较

4 吴茱萸碱对各组大鼠肺组织内血小板与中性粒细胞聚集程度的影响

与对照组相比，模型组大鼠肺组织内血小板-中性粒细胞合光密度显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，吴茱萸碱低剂量组、吴茱萸碱高剂量组大鼠肺组织内血小板-中性粒细胞合光密度均降低（P＜0.05），空载组大鼠肺组织内血小板-中性粒细胞合光密度无明显变化（P＞0.05）；与吴茱萸碱低剂量组相比，吴茱萸碱高剂量组大鼠肺组织内血小板-中性粒细胞合光密度降低（P＜0.05）；与吴茱萸碱高剂量组相比，吴茱萸碱高剂量+HMGB1过表达组大鼠肺组织内血小板-中性粒细胞合光密度升高（P＜0.05）。见图5、表1。

表1 各组大鼠肺组织内血小板-中性粒细胞合光密度（n=6，）

表1 各组大鼠肺组织内血小板-中性粒细胞合光密度（n=6，）

注：与对照组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与吴茱萸碱低剂量组相比，cP＜0.05；与吴茱萸碱高剂量组相比，dP＜0.05。

组别合光密度对照组21.82±0.70模型组 33.14±2.65a吴茱萸碱低剂量组 27.89±1.21b吴茱萸碱高剂量组 22.21±0.83bc空载组34.02±2.33吴茱萸碱高剂量+HMGB1过表达组 32.78±2.42d F 21.439 P＜0.001

图5 免疫荧光染色检测各组大鼠肺组织内血小板与中性粒细胞聚集情况（×200）

5 吴茱萸碱对各组大鼠BALF及血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平的影响

与对照组相比，模型组大鼠BALF及血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，吴茱萸碱低剂量组、吴茱萸碱高剂量组大鼠BALF及血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平均降低（P＜0.05），空载组大鼠BALF及血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平无明显变化（P＞0.05）；与吴茱萸碱低剂量组相比，吴茱萸碱高剂量组大鼠BALF及血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平均降低（P＜0.05）；与吴茱萸碱高剂量组相比，吴茱萸碱高剂量+HMGB1过表达组大鼠BALF及血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平均升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠baLF及血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平（n=12，）

表2 各组大鼠baLF及血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平（n=12，）

注：与对照组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与吴茱萸碱低剂量组相比，cP＜0.05；与吴茱萸碱高剂量组相比，dP＜0.05。

组别baLF血清TNF-α（pg/mL）IL-1β（pg/mL）TNF-α（pg/mL）IL-1β（pg/mL）对照组13.58±3.2423.62±3.7223.12±4.1532.64±5.12模型组 78.75±11.57a 94.56±12.91a 105.84±13.42a 129.41±16.53a吴茱萸碱低剂量组 46.86±13.06b 59.84±9.22b 66.12±9.64b 81.84±15.24b吴茱萸碱高剂量组 15.97±2.86bc 26.03±3.52bc 27.11±4.83bc 37.98±6.15bc空载组 79.52±12.73 92.64±14.23108.57±16.12132.13±17.01吴茱萸碱高剂量+HMGB1过表达组 73.10±12.54d 89.05±13.48d 97.93±14.40d 120.96±13.93d F 23.46819.28529.73116.734 P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

6 吴茱萸碱对各组大鼠肺组织HMGB1/TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达的影响

与对照组相比，模型组大鼠肺组织HMGB1、TLR4蛋白表达与p-NF-κB p65/NF-κB p65显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，吴茱萸碱低剂量组、吴茱萸碱高剂量组大鼠肺组织HMGB1、TLR4蛋白表达与p-NF-κB p65/NF-κB p65均降低（P＜0.05），空载组大鼠肺组织HMGB1、TLR4蛋白表达与p-NF-κB p65/NF-κB p65无明显变化（P＞0.05）；与吴茱萸碱低剂量组相比，吴茱萸碱高剂量组大鼠肺组织HMGB1、TLR4蛋白表达与p-NF-κB p65/NF-κB p65均降低（P＜0.05）；与吴茱萸碱高剂量组相比，吴茱萸碱高剂量+HMGB1过表达组大鼠肺组织HMGB1、TLR4蛋白表达与p-NF-κB p65/NF-κB p65均升高（P＜0.05）。见图6、表3。

表3 各组大鼠肺组织HMGb1、TLR4蛋白表达与p-NF-κb p65/NF-κb p65（n=6，）

表3 各组大鼠肺组织HMGb1、TLR4蛋白表达与p-NF-κb p65/NF-κb p65（n=6，）

注：与对照组相比，aP＜0.05；与模型组相比，bP＜0.05；与吴茱萸碱低剂量组相比，cP＜0.05；与吴茱萸碱高剂量组相比，dP＜0.05。

组别HMGb1/β-actinTLR4/β-actinp-NF-κb p65/NF-κb p65对照组 0.13±0.020.21±0.040.30±0.05模型组 0.97±0.12a 1.08±0.15a 1.16±0.18a吴茱萸碱低剂量组 0.56±0.05b 0.65±0.06b 0.73±0.11b吴茱萸碱高剂量组 0.15±0.03bc 0.24±0.02bc 0.33±0.04bc空载组 0.99±0.141.06±0.171.17±0.19吴茱萸碱高剂量+HMGB1过表达组 0.92±0.16d 1.04±0.12d 1.12±0.13d F 20.13615.21922.438 P＜0.001＜0.001＜0.001

图6 免疫印迹检测各组大鼠肺组织HMGB1/TLR4/NF-κB通路相关蛋白表达

讨 论

发生TRALI时应立即停止输血，进行及时治疗，如今临床中以氧疗、机械通气改善氧合等对症治疗手法为主，但患者死亡率仍然较高，但除此之外尚无其他特别有效且可靠的特异性治疗方法[15]。TRALI发病机制复杂，“二次打击”机制得到了广泛认同及大量研究支持，第一次打击是由严重的感染或脓血症引起，导致内皮和中性粒细胞激活，第二次打击是由输入的血液制品引起，血液制品中的白细胞抗体和患者体内白细胞产生了抗原-抗体免疫反应，使内皮和中性粒细胞进一步激活，加重了肺血管内皮细胞的打击损伤，最终导致TRALI发生[16]。本实验在上述理论的指导下采用了腹腔注射LPS联合输注人血浆的方法制备TRALI模型，结果显示造模大鼠BALF细胞总数、中性粒细胞百分比、BALF及血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平均高于正常大鼠，且造模大鼠肺组织出现出血、水肿、大量炎性细胞浸润与肺泡壁增厚、间隔加宽等病理症状，造成大鼠肺功能受损，揭示TRALI大鼠模型制备成功。

吴茱萸碱作为吴茱萸中一种天然生物碱，可通过抗菌消炎、提高免疫等活性在溃疡性结肠炎、胃溃疡、肺炎等疾病中发挥治疗作用[17-19]。董悦等[20]发现吴茱萸碱可作为香连片的起效成分之一，在新型冠状病毒肺炎的治疗中发挥作用。张莹等[9]发现，吴茱萸碱可通过抑制NF-κB通路，减少炎症介质（TNF-α、IL-6）释放，减轻脓毒症小鼠的急性肺损伤；FAN等[10]的研究显示，吴茱萸碱可抑制TNF-α、IL-1β、IL-6表达，并通过抑制NF-κB通路活化改善肺组织的异常状态，抑制体外和体内的炎症反应。本文结果显示，以吴茱萸碱处理TRALI大鼠，相比正常大鼠，TRALI大鼠肺功能指标MV、PEF升高，Ri降低，表明吴茱萸碱可改善大鼠肺功能；同时，吴茱萸碱可降低TRALI大鼠肺湿干比、肺组织病理评分、肺组织内血小板-中性粒细胞合光密度、BALF细胞总数、中性粒细胞百分比、BALF及血清促炎因子TNF-α、IL-1β水平，减轻肺组织病理损伤症状，表明吴茱萸碱可抑制中性粒细胞激活，减少促炎因子释放，减轻TRALI大鼠肺组织炎症损伤及肺水肿症状，揭示吴茱萸碱在TRALI的治疗中有一定的应用前景。

HMGBl/TLR4/NF-κB通路可通过调控炎症介导各种因素引发的肺损伤疾病的发生发展，下调HMGBl/TLR4通路蛋白表达可阻滞NF-κB信号传导，减少促炎细胞因子产生释放，减轻肺损伤[21-22]。研究显示，TLR4在TRALI的病理过程中表达增强[23]，且降低HMGB1表达可保护内皮细胞和组织器官免于输血引发的炎性损伤[6]；本研究结果显示，TRALI大鼠肺组织HMGB1、TLR4蛋白表达与p-NF-κB p65/NF-κB p65比值均升高，表明TRALI大鼠肺组织中HMGBl/TLR4/NF-κB通路被激活。WANG等[11]的研究显示吴茱萸碱对哮喘大鼠气道炎症和肺组织重塑的改善作用是通过抑制HMGB1/NF-κB/TLR4信号通路激活实现的，表明抑制HMGB1/NF-κB/TLR4信号通路是吴茱萸碱发挥生物学活性的靶点之一。在本研究中，吴茱萸碱处理可降低TRALI大鼠肺组织中HMGB1、TLR4蛋白表达与p-NF-κB p65/NF-κB p65比值，表明吴茱萸碱处理可抑制HMGB1/NF-κB/TLR4信号通路活化。因此，推测吴茱萸碱对TRALI大鼠肺损伤的改善机制可能与阻止HMGB1/TLR4/NF-κB信号传导有关。为了验证此推测，本研究以吴茱萸碱处理TRALI大鼠的同时过表达HMGB1，结果显示，过表达HMGB1可减弱吴茱萸碱单独处理对TRALI大鼠中性粒细胞激活的抑制作用，消除其对大鼠肺组织炎症损伤及肺水肿症状的减轻作用，最终逆转吴茱萸碱对大鼠肺功能的改善作用，揭示吴茱萸碱改善TRALI大鼠临床症状是通过下调HMGB1表达实现的。

综上所述，吴茱萸碱可下调HMGB1、TLR4表达并减弱NF-κB磷酸化，进而减少促炎细胞因子表达释放，抑制输血诱导的中性粒细胞激活，减轻TRALI大鼠肺组织炎症损伤，改善其肺水肿及肺功能障碍症状，抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号激活可能是吴茱萸碱改善TRALI大鼠临床症状的药理机制，本文证实了吴茱萸碱可作为TRALI的候选治疗药物，表明其具有一定的研发价值，对于保障安全输血及改善TRALI预后起到一定积极作用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突