达雷妥尤单抗对凝聚胺技术检出IgG抗D抗体的影响

刘慧 卓海龙 骆群

解放军总医院第五医学中心输血医学科，北京 100071

多发性骨髓瘤（MM） 是由克隆浆细胞异常增殖引起的恶性血液病，目前尚无法治愈[1]，此类患者经常因贫血需要输血。自1975年单克隆抗体（以下简称单抗） 技术诞生以来，抗体工程技术飞速发展，抗体药物以其特异性高、半衰期长、不良反应少等特点，在治疗多发性骨髓瘤等疾病上取得了令人瞩目的临床疗效，但由于某些抗体（如CD38单抗和CD47单抗）的作用靶点不仅在肿瘤细胞上表达，也在红细胞上表达，故可能会对相关输血相容性检测产生干扰，掩盖其他的同种异体抗体，进而导致临床输血困难或延迟[2]。因此应用CD38单抗治疗的患者紧急输血时，输血的安全性及有效性尤为重要，如何快速及准确地为患者发放血液，是目前面临的最大问题。

目前国内常用的克服CD38单抗干扰输血相容性检测的方法是凝聚胺技术，及使用巯基还原剂[二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）或2-巯基乙醇（2-mercaptoethanol，2-Me）]处理红细胞[2]。国际上最常用的消除CD38单抗干扰的方法是DTT处理红细胞[3]。然而我国巯基试剂并不是输血检测的常用试剂，且巯基试剂处理红细胞，耗时长，步骤繁琐，对于需要紧急输血的患者，不能及时供应血液。巯基试剂除了使CD38抗原失活外，还可通过裂解血型抗原的二硫键来减弱或破坏某些抗原，如Kell血型系统、Knops血型系统的大部分抗体、抗-LWa、抗-Yt、抗-Do、抗Gya、抗Hy、抗Joa等对巯基试剂敏感的红细胞抗原，且巯基试剂具有一定的毒性，长时间接触皮肤可致癌，高浓度巯基有催眠麻痹神经的作用，故使用巯基试剂破坏抗体时一定要做好防护措施[4-5]。因此，使用巯基试剂处理红细胞仍存在许多缺点，为了克服达雷妥尤单抗对输血相容性检测的干扰，我们需要一种更加方便快速且对人体危害小的方法。

凝聚胺技术是一种不完全抗体检验方法，具有成本低，操作简便快速、灵敏度高等特点。凝聚胺法对CD38单抗药物致敏的红细胞所产生的特异性反应不敏感，原理为CD38分子为Ⅱ型跨膜糖蛋白，是羧基位于细胞膜外的膜蛋白，在低离子环境下极易与凝聚胺分子结合，从而减少了CD38分子与CD38单抗特异性结合的机会。因此，凝聚胺技术在临床输血检验中具有较大应用优势[6-7]。在临床患者需要紧急输血时，为了消除达雷妥尤单抗的干扰，凝聚胺技术就显得尤为重要，但达雷妥尤单抗对凝聚胺技术检出IgG抗D抗体是否存在干扰还有待进一步研究。本文将加入商品化的IgG抗D抗体的样本作为阳性对照组；加入IgG抗D抗体和达雷妥尤单抗的样本作为实验组；不加入IgG抗D抗体和达雷妥尤单抗的样本作为阴性对照组，将三组样本分别用微柱凝胶卡法和凝聚胺法进行抗体筛查试验，观察达雷妥尤单抗对凝聚胺法检出IgG类抗D抗体的影响。

材料与方法

1 标本来源

由解放军总医院第五医学中心输血医学科提供的AB型Rh（D）阳性、不规则抗体筛查试验阴性的血浆标本10份，患者均为男性健康献血者。均已征得患者知情同意。

2 试剂与仪器

凝聚胺介质试剂（珠海贝索生物技术有限公司）；抗D（IgG）血型定型试剂（上海血液生物医药有限责任公司）；达雷妥尤单抗注射液（兆珂，注册证号S20190030，生产厂家 Cilag AG，规格 400 mg/20 mL）；红细胞血型技术筛选细胞（微柱凝胶法）（盖立复诊断股份公司）；血型分析用稀释液（盖立复诊断股份公司）；AB型阳性血浆（解放军总医学第五医学中心输血医学科）；抗人球蛋白检测卡（微柱凝胶法）（盖立复诊断股份公司）；离心机DG-SPIN（GRIFOLS）；孵育机DG-THERM（GRIFOLS）；离心机KA-2200（北京东讯天地医疗仪器有限公司）。

3 方法

3.1 实验分组

选取10人份AB型RhD阳性、不规则抗体筛查试验阴性的血浆标本，将每份标本各分装2 mL于3个试管中，分为3组，即阴性对照组、阳性对照组和实验组。不加入IgG抗D和达雷妥尤单抗的为阴性对照组；加入20 μL商品化的IgG抗D抗体作为阳性对照组；加入20 μLIgG抗D抗体和20 μL达雷妥尤单抗作为实验组。

3.2 达雷妥尤单抗浓度的推算

成人在使用达雷妥尤单抗治疗时，用药剂量为16 mg/kg，模拟人体用药，在2 mL血浆样本中加入20 μL达雷妥尤单抗注射液，推算实验组样本中达雷妥尤单抗的浓度。

3.3 不规则抗体筛查试验

分别用微柱凝胶卡法和凝聚胺法进行不规则抗体筛查试验。

微柱凝胶卡法：在抗人球蛋白检测卡相应的微孔管中加入50 μL抗体筛查的红细胞反应液，加入25 μL血浆样本，37 ℃孵育15 min，使用DG专用离心机离心并读取结果；

凝聚胺法：取试管3支，各加被检血浆样本2滴，分别加入3%～5%抗体筛检红细胞1滴，LIM 0.65 mL，混匀后，再各加Polybrene溶液2滴，混匀，3 400 r/min离心10 s，去上清，管底残留约0.1 mL液体，轻轻摇动试管，观察有无凝集，最后加入重悬液2滴，轻轻混匀并观察结果。

3.4 IgG类抗D抗体检测下限滴度测定

将加入IgG抗D抗体的20份血浆样本进行倍比稀释至1∶256，模拟人体用药，实验组加入定量的达雷妥尤单抗，分别用微柱凝胶卡法和凝聚胺法检测阳性对照组和实验组的IgG抗D抗体滴度，观察各组IgG抗D抗体检测下限的滴度。

3.5 凝集强度评分标准

3.6 不规则抗体筛查试剂细胞谱

4 统计学分析

结 果

1 样本中达雷妥尤单抗的浓度

经模拟人体用药，在2 mL血浆样本中加入20 μL达雷妥尤单抗注射液，经推算实验组血浆样本中达雷妥尤单抗的浓度约为2 mg/mL。

表1 凝集强度评分

表2 不规则抗体筛查试剂细胞谱

2 微柱凝胶卡法抗体筛查的结果

阴性对照组：抗体筛查结果为阴性；阳性对照组：抗体筛查结果为Ⅰ号、Ⅱ号阳性（2+），Ⅲ号阴性，检测出的为抗D抗体；实验组：抗体筛查结果为Ⅰ号、Ⅱ号阳性（2+），Ⅲ号（1+）（见表3，见图1）。

图1 微柱凝胶卡法的抗体筛查结果

表3 10组标本微柱凝胶卡法抗体筛查结果（n=10）

3 凝聚胺法抗体筛查的结果

阴性对照组：抗体筛查结果为阴性；阳性对照组：抗体筛查结果为Ⅰ号、Ⅱ号阳性（1+），Ⅲ号阴性，检测出的为抗D抗体；实验组Ⅰ号、Ⅱ号阳性（1+），Ⅲ号阴性，检测出的为抗D抗体（见表4，见图2）。

图2 凝聚胺法的抗体筛查结果

表4 10组标本凝聚胺法抗体筛查结果（n=10）

4 微柱凝胶卡法IgG抗D抗体检测下限滴度的确定

将实验组和阳性对照组的血浆样本倍比稀释后，阳性对照组微柱凝胶卡法对IgG抗D抗体的检测下限滴度为1∶64，实验组受达雷妥尤单抗的影响，无法测出微柱凝胶卡法对IgG抗D抗体的检测下限（见图3、4）。

图3 阳性对照组微柱凝胶卡法倍比稀释后的IgG抗D抗体检测结果

图4 实验组微柱凝胶卡法倍比稀释后的IgG抗D抗体检测结果

5 微柱凝胶卡法和凝聚胺法抗体筛查实验评分结果

微柱凝胶卡法的抗体筛查试验结果，实验组（23.80±1.40）与阳性对照组（18.80±1.40）评分比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；凝聚胺法的抗体筛查试验结果，实验组（14.80±2.53）与阳性对照组（14.80±2.53）评分比较，无统计学意义（P＞0.05）（见表5）。

表5 10组标本微柱凝胶卡法和凝聚胺法抗体筛查实验结果评分对比（）（n=10）

表5 10组标本微柱凝胶卡法和凝聚胺法抗体筛查实验结果评分对比（）（n=10）

注：微柱凝胶卡法抗体筛查结果，a与阳性对照组相比，t=7.995，P＜0.05；凝聚胺法抗体筛查结果，b与阳性对照组相比，t=0，P＞0.05。

阴性对照组阳性对照组实验组微柱凝胶卡法0.00±0.0018.80±1.4023.80±1.40a凝聚胺法0.00±0.0014.80±2.5314.80±2.53b

6 凝聚胺法IgG抗D抗体检测下限滴度的确定

将实验组和阳性对照组的血浆样本倍比稀释后，阳性对照组和实验组凝聚胺法IgG抗D抗体的检测下限均为1∶64（见图5、6）。

图6 实验组凝聚胺法倍比稀释后的IgG抗D抗体检测结果

讨 论

达雷妥尤单抗是一种人源化、抗CD38 IgG1单克隆抗体，可以有效地与肿瘤细胞表面的CD38分子结合，通过多种机制清除肿瘤细胞，用于治疗多发性骨髓瘤等多种血液系统疾病。CD38不仅在肿瘤细胞上高表达，在红细胞、血小板上也表达，达雷妥尤单抗与试剂红细胞上的CD38分子结合，导致抗体筛查阳性，掩盖潜在的同种异体抗体，干扰患者输血前血清学检测。研究表明，患者在停用达雷妥尤单抗后，阳性反应可能会持续6个月[8]。红细胞同种抗体是引起溶血性输血反应、红细胞输注无效等的主要原因，输血前血清同种异体抗体的筛查与鉴定对患者的输血安全性及有效性尤为重要[9]。抗D抗体的产生一般是由于异体输血或者怀孕时母婴Rh血型不合引起，该抗体是IgG性质的抗体，容易引起溶血性输血反应。

目前对于应用达雷妥尤单抗药物的临床输血患者，常用的配血技术是抗人球技术，DTT试剂处理抗筛红细胞和供者红细胞后，应用抗人球法进行红细胞抗体筛查和交叉配血试验。在临床工作中，使用DTT试剂预处理红细胞再进行输血前相容性的检测至少需要2～3 h，步骤繁琐且耗时长，DTT试剂具有一定毒性且试剂昂贵，在国内大多数实验室并不常用，不能及时为临床提供安全有效的血液制品，延迟输血可能对患者造成严重后果[10]。

凝聚胺技术也是临床常用的输血相容性检测技术，其操作简单快速，且CD38分子在胞外带负电荷的羧基，在低离子环境下极易与凝聚胺分子结合，进而可以干扰红细胞表面CD38分子与达雷妥尤单抗的结合[2]，克服达雷妥尤单抗对输血相容性检测的干扰，但患者体内若存在抗D抗体，应用凝聚胺技术进行输血相容性检测时，达雷妥尤单抗是否会影响IgG抗D抗体的检出还有待研究，因此本文将IgG抗D试剂加入到实验组样本中，研究达雷妥尤单抗对凝聚胺技术检出IgG抗D抗体的影响。

本文研究显示，未加入达雷妥尤单抗时，微柱凝胶卡法和凝聚胺法可以检测出样本中的IgG抗D抗体，且倍比稀释后的检测下限滴度为1∶64。加入达雷妥尤单抗后，微柱凝胶卡法受达雷妥尤单抗的影响，无法检出IgG抗D抗体，而凝聚胺技术可以避免达雷妥尤单抗的干扰，不影响IgG抗D抗体的检出，倍比稀释后，达雷妥尤单抗不会影响IgG抗D抗体的检测下限，检测下限滴度为1∶64。在凝聚胺实验中，倍比稀释后，1∶64为阳性，1∶128为阴性，那1∶100结果如何，该检测下限滴度还有待进一步研究。

因此，多发性骨髓瘤患者及其他在经达雷妥尤单抗治疗后的患者在需要紧急输血时，可以选择用凝聚胺法进行输血前检测，达雷妥尤单抗不会影响IgG抗D抗体的检出，可保障此类患者紧急输血的安全性和有效性。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突