前S1抗原检测阴性的HBV感染孕妇血清学和前S1基因特征分析*

姜天琪 孙可望 王皓 黄象艳

1山东中医药大学 250014；2山东省妇幼保健院 250014；3解放军联勤保障部队第九六〇医院输血医学科 250031

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）在世界范围内仍然是一个重要的公共卫生问题[1]，中国属于HBV中高度流行区， HBV感染占全球超过1/3，每年新发病例接近10万人[2]。据估算，我国慢性HBV感染者约7 000万例，其中慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者约为2 000万～3 000万例[3]。2021年中国乙型肝炎新增报告病例102.88万人，死亡人数386人；2022年1月—2月，乙型肝炎报告病例20.63万人，死亡病例67人[4]，目前HBV感染仍是我国最为严重的传染性疾病之一。孕妇是HBV的易感者，母婴传播是我国HBV感染的主要传播途径，而引起HBV感染率较高的原因则与缺乏有效的母婴HBV感染诊疗手段有关[5]。所以对于这类人群的HBV感染指标监测具有重要的意义。长期以来各实验室都是以血清学乙肝五项标志物检测作为HBV感染指标监测的重要手段，但由于HBV突变和免疫逃逸等原因，使这些血清学检测结果受到影响，因此，研究表明HBV DNA才是判断乙肝病毒有无复制的“金标准”[6]。但在我国，大部分基层医疗机构无法常规开展HBV DNA检测，因此临床迫切需要更多敏感指标，以便在HBV发展的早期进行诊断，从而进行有效的治疗。血清内Pre-S1Ag是HBV基因前S1区编码的产物，参与介导病毒颗粒附宿至肝细胞，并直接反应HBV DNA的血清浓度，Pre-S1Ag和HBV DNA有着极为密切的关系，可以直接反映病毒的活性和复制状态，而且与HBsAg滴度呈正相关[7]。近年来，血清Pre-S1Ag作为传统血清学乙肝五项标志物检测的有利补充[8]，也被临床越来越重视，已广泛应用于HBV感染的诊断。然而在实际工作中偶尔会遇到HBsAg阳性而Pre-S1Ag阴性的检测模式，这不仅给检验人员报告发放和结果解释带来一定的困扰，也让临床医生对患者检测结果产生疑问，影响判断，出现这种模式的原因有待进一步探讨。因此，本研究以孕期妇女为研究对象，采用化学发光法、聚合酶链反应（PCR）和测序对研究标本进行乙肝五项、Pre-S1Ag和HBV DNA分析，旨在探讨HBV感染孕妇中Pre-S1Ag阴性的发生原因，为HBV感染孕妇的检测诊断和减少HBV母婴传播提供参考。

材料与方法

1 研究样本

收集2021年7月—2022年12月山东省妇幼保健院428份HBV感染孕妇的血液样本，根据血清学结果选取HBsAg阳性而Pre-S1Ag阴性的标本共14例做为实验组（编号E1～E14号），年龄28～36岁，平均为（32.8±2）岁；随机选取HBsAg和Pre-S1Ag均阳性的20例标本为对照组（C1～C20号），年龄22～40岁，平均为（31.5±4.6）岁。两组患者的年龄、性别等比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。本研究经山东省妇幼保健院伦理委员会审批通过（批准号：NO.2021-117）

2 血清学检测

使用希森美康HISCL-5000全自动化学发光分析仪（化学发光免疫分析法）对血清样本进行HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc检测。结果的判断为：≥0.03 IU/mL时，HBsAg阳性；≥5 mIU/mL时，HBsAb阳性；COI≥1时，HBeAg和HBcAb阳性；Inh%≥50时，HBeAb阳性。使用莱博HB-300C电化学发光分析仪（化学发光法）对血清样本进行Pre-S1Ag检测，测定每孔发光强度（RLU）值后计算S/CO值，S/CO＞1时判断为阳性。所有试验均严格按照试剂盒说明书进行。

3 HBV DNA核酸检测

使用达安HBV核酸测定高敏试剂盒在AGS4800实时荧光定量PCR仪上对实验组和对照组标本进行PCR定量检测，记录结果。试剂盒最低检测限HBV DNA浓度为10 IU/mL。所有试验均严格按照试剂盒说明书进行。

4 HBV PreS/S基因的扩增

实验组和对照组标本使用QIAamp MinElute病毒核酸离心纯化试剂盒提取DNA，使用lightCycler480ⅡPCR扩增仪行HBVPreS/S基因巢氏PCR。第一轮PCR扩增条件是：94℃变性90 s后，98℃变性10 s，56℃退火15 s，72℃延伸60 s，循环数40，使用引物分别为P1（5'-TTCTTGGGAACAAGAGCTAC-3'）和R2（5'-GCAAAGCCCAAAAGACCCACAAT-3'），其PCR产物包含PreS和S基因，长度1 383 bp。将该产物稀释50倍用于第二轮PCR，扩增条件是：94°C变性90 s后，98℃变性10 s，56℃退火60 s，72℃延伸90 s，循环数40，使用引物分别为S1（5'-ATGGGGACAAATCTTTCTGTTCCCAA-3'）和S2（5'-GTTCGGTGCAGGGTCCC-3'），其PCR产物包含PreS1、PreS2，长度489 bp。

5 基因分型和测序分析

PCR产物进行电泳，电泳后观察扩增结果。使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司FastPure Gel DNA提取纯化试剂盒从琼脂糖凝胶中回收扩增产物，并进行纯化，送上海生工公司测序。使用NCBI网站BLAST（https：//blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在线进行序列分析和比对。根据测序结果在NCBI网站使用基因分型工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/ formpage.cgi）进行HBV基因分型。

6 统计学分析

使用IBM SPSS软件（版本21.0）对实验结果及相关的临床资料进行统计学分析，计数资料以“率”表示，因例数较少组间比较采用Fisher确切概率法，计量资料采用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 HBV感染孕妇Pre-S1Ag检测情况分析

本研究中HBV感染孕妇中Pre-S1Ag阳性率为96.73%，HBsAg阳性而Pre-S1Ag阴性的特殊情况占比3.27%。HBV感染孕妇的乙肝五项血清学检测模式有5种，不同检测模式下Pre-S1Ag阴性的发生率不同，如表1所示。可见HBsAg、抗-HBe、抗-HBc阳性模式和HBsAg、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc阳性模式

表1 不同乙肝感染模式Pre-S1Ag阴性检测情况

中存在Pre-S1Ag阴性的情况，而其他HBV感染模式组中未发现Pre-S1Ag阴性。Pre-S1Ag阴性标本HBV DNA含量较低，见表1。

2 实验组和对照组HBeAg、抗-HBe阳性率分析

实验组中仅出现1例HBeAg阳性的样本，阳性率为7.1%，对照组HBeAg阳性率70%，两组比较有显著性差异（P＜0.001）；实验组14例样本全部抗-HBe阳性，阳性率为100%，对照组抗-HBe阳性率30%，两组比较有显著性差异（P＜0.001），见表2。

表2 实验组和对照组孕妇HBeAg、抗-HBe阳性率分析

3 实验组和对照组HBsAg与HBV DNA检测结果分析

对照组中HBsAg、HBV DNA定量结果要远远高于实验组（P＜0.001），说明实验组和对照组之间存在显著的差异，Pre-S1Ag会随着HBsAg及HBV DNA含量的降低而出现阴性，结果见表3。

表3 实验组和对照组孕妇HBsAg与HBV DNA检测结果分析

4 HBV PreS基因分型和测序

标本经测序和基因分型，对照组中3例（C1、C4、C9）为B基因型、其余17例为C基因型；实验组14例均为C基因型。通过与对应基因型的核酸和氨基酸标准序列比对，发现实验组E2、E3、E5、E6、E7五个标本与对照组C1、C2、C4、C9、C15、C19、C20七个标本在PreS1基因区域内存在变异（表4），其余标本未发现PreS1突变。Pre-S1含119个氨基酸，实验组14个标本Pre-S1氨基酸位点共计1 666个，其中发现变异位点9个；对照组20个标本Pre-S1氨基酸位点共计2 380个，发现变异位点12个，通过Fisher确切概率法统计分析，两组变异发生率无统计学意义（P＞0.05），见表5。

表4 HBV PreS1区氨基酸变异分析

表5 两组标本HBV PreS1区氨基酸变异率

讨 论

HBV是威胁人类健康的主要传染性病原体，HBV血清学标志物的检测是诊断HBV感染和确定感染阶段的有效方法[9]。传统的乙肝五项血清学检测分析的灵敏度提高使HBV传播的危险性大为减少，但并不能完全杜绝。孙珍[10]等的研究指出，如果HBV处于低水平复制期，那么乙肝五项并不能准确的检出病毒。HBV属嗜肝DNA病毒科（Hepadnavividae），具有独特的基因结构，是含有部分单链区的环状双链DNA病毒，分为长链（L） 和短链（S），长链有4个开放性读框（ORF），即S区、C区、P区和X区。其中S区包括前S1（Pre-S1）、前S2（Pre-S2）和S区基因，编码Pre-S1、Pre-S2和S三种外壳蛋白，三种蛋白均属于HBV的结构蛋白，通过组装完整病毒颗粒，诱导机体体液和细胞免疫应答[11]。Pre-S1抗原是HBV基因组Pre-S1区编码的前蛋白，具有很强的免疫原性，是乙肝表面抗原的重要组成成分，在一定程度上反映HBV的复制性和传染性[12]，在病毒侵入肝细胞过程中起了很重要的作用。也有研究[13]表明，作为HBV外膜蛋白的Pre-S1Ag在感染宿主细胞过程中起重要作用，与HBV DNA有良好的相关性，可作为HBV感染和复制的重要依据。我们的研究结果也证实了这一点，即Pre-S1Ag阳性感染者中HBV DNA水平相对高。

针对实际工作中标本能检测到HBsAg和HBV DNA，但Pre-S1Ag却是阴性的情况，本研究分析了其可能的发生原因。本研究结果显示HBV感染孕妇中存在这种特殊的检测模式，比例不高，但主要存在于HBV感染后已产生抗-HBe并且HBsAg水平相对偏低的个体中。明翠玲[14]等人的研究指出PreS1Ag检测在客观真实地反映HBeAg阳性患者HBV病毒复制情况的同时，能较敏感地反映HBeAg阴性患者是否存在病毒复制，本研究中Pre-S1Ag阴性的个体HBeAg水平相对偏低或检测不到，加之，结果提示Pre-S1Ag阴性与HBV DNA低水平相关，反映了实验组中的HBV感染孕妇的病毒复制处于低水平。HBV由于其独特的特征而具有较高的突变率，前S/S基因突变会改变检测试剂中抗体的结合位点，导致假阴性的结果[15]。有文献报道[16]，HBV Pre-S1蛋白在病毒侵入肝细胞过程中起重要作用，介导部位的氨基酸变异可能影响其传染性。孙慧珍[17]等人的研究指出，C基因型中，pre-S1区域的T97A、Q104K/R突变体会导致细胞外和细胞内HBsAg水平显著降低。但本研究测序结果中仅有一例对照组样本存在T97A突变，且实验组Pre-S1基因变异率与对照组无明显差异，所以推测HBV感染孕妇Pre-S1Ag检测失败与Pre-S1基因变异相关性不大；同时实验组HBsAg、HBV DNA含量较低，推测Pre-S1Ag的无反应性是由于HBV Pre-S1Ag含量低于检测限导致。所以这对于Pre-S1Ag试剂的灵敏度提出了更高的要求，高灵敏Pre-S1Ag试剂将有助于准确诊断HBV感染情况。

中国是乙型肝炎的高度流行区，慢性HBV感染者众多， 其中大多来自母婴传播感染或儿童期感染[18]，本研究中， HBV感染孕妇存在一定比例Pre-S1Ag阴性的情况，虽然其HBV DNA含量偏低，但不能明确表明机体不存在HBV的现症感染情况，仍存在垂直传播的风险，仍需引起重视。现今的乙肝治疗指南，已将乙肝肝硬化患者的治疗指征，从以前的HBV DNA＞200 IU/mL拓展为“HBV DNA阳性”即启动治疗，可能在未来更新的指南中，针对HBV感染孕妇群体同样也是HBV DNA阳性即启动治疗，从而更早控制病毒复制，减少垂直传播的发生率。此外，由于实际工作中Pre-S1Ag阴性的HBV感染孕妇比例较低，本次研究收取的样本数量有限，这使得研究结果也有一定的局限性，因此还需要进一步的探究。

综上所述，应重视孕妇乙肝五项、Pre-S1Ag和HBV DNA联合检测。常规血清学检测有助于了解孕妇HBV感染现状及流行趋势，同时不能忽视Pre-S1Ag阴性的孕妇HBV感染状况，必要时进行核酸检测，早期发现，从而促进临床对其进行有效的抗病毒治疗和母婴阻断，达到优生优育，提高母婴健康的目的。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突