安徽铜陵地区首例血流感染耳念珠菌的耐药性及溯源分析*

潘恺 陈继中 王中新 胡志军 朱娟娟

1安徽省铜陵市人民医院，安徽铜陵 244000，2安徽医科大学第一附属医院，安徽合肥 230000

耳念珠菌由日本在2009年首次报道，分离于一名患者外耳道内而得名，其对临床常规抗真菌感染治疗药物的高度耐药性和高致死率，易引起医院内感染暴发事件发生，因此被称为“超级真菌”[1-2]，目前质谱系统和基因测序具有较高的精准性，广泛应用于临床的病原微生物菌种鉴定，本文应用该方法对中国安徽省某三甲医院重症医学科一例血流感染耳念珠菌患者的病例进行分析报道。

资料与方法

1 一般资料

男性患者，77岁，2021年9月21日因“颈椎椎体手术后突发呼吸心跳骤停”转入重症监护病房，入院诊断为（1）呼吸心跳骤停，（2）缺血缺氧性脑病后遗症，（3）2型糖尿病，（4）高血压，（5）高脂血症。入住重症监护病房后予以机械通气、维持血压、脑保护、抗细菌感染等治疗，患者入院后一直处于浅昏迷状态，长期鼻饲、留置导尿管。血液、呼吸、心血管系统查体未见异常。2022年5月22日—6月1日因痰培养和中段尿培养检出泛耐药肺炎克雷伯菌及泛耐药鲍曼不动杆菌先后调整哌拉西林-他唑巴坦、美罗培南、替加环素三种抗菌药物抗细菌感染治疗。抗细菌感染期间，真菌（1，3）-β-D葡聚糖试验结果未见异常（＜60 pg/mL）。6月2日（1，3）-β-D葡聚糖的检测结果为150.10 pg/mL，提示患者深部真菌感染。2022年6月5日患者复查真菌（1，3）-β-D葡聚糖检测结果为220.40 pg/mL。同日送检的血液培养及静脉导管细菌培养均于6月6日报阳，随即抽取血培养瓶中的培养基转种哥伦比亚血琼脂平板和沙堡弱斜面琼脂并涂片革兰染色，涂片可见酵母样真菌孢子，见图1，支持酵母样真菌血流及导管感染判断。

图1 血培养直接涂片

6月8日临床科室经验治疗给予卡泊芬净50 QD静脉滴注治疗方案，6月15日再次送检双侧双瓶血液培养依然检出耳念珠菌。该患者基础性疾病多，多器官功能衰竭，长期卧床，免疫力低下，耳念珠菌的高毒力表现和多重耐药性导致抗真菌治疗效果不佳，患者于6月23日临床死亡。

2 仪器和试剂

血液培养仪使用BD BACTEC FX全自动培养系统；菌株鉴定使用生物梅里埃的VITEK 2 COMPACT全自动微生物鉴定系统和重庆中元公司产品的EXS1000全自动微生物飞行时间质谱鉴定系统；沙堡弱琼脂培养基、血琼脂平板和CHROmagar念珠菌显色平板选用江门市凯林贸易有限公司产品，真菌（1，3）-β-D葡聚糖检测试剂盒（光度法）使用北京金山川科技发展有限公司产品。

3 方法

真菌菌种鉴定使用飞行时间质谱系统的甲酸裂解法[3-4]；本研究中使用的其他耳念珠菌的内部转录间隔区（ITS）序列均来自于NCBI的Blast数据库；一代测序委托安徽合肥金域医学检验实验室进行检测，使用引物ITS1及ITS4的序列分别为5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；全基因组测序委托上海生工生物工程公司检测；系统发育树使用MEGA7.0软件进行绘制。

结 果

1 VITEK2和质谱系统鉴定结果

抽取血培养瓶样本转种在血琼脂平板和沙堡弱斜面琼脂上，二者分别置于36℃和28℃下进行培养，18 h后两培养基表面均可见乳白色奶油状凸起菌落生长。随即使用VITEK2的YST酵母菌鉴定卡鉴定，得出的结果为耳念珠菌，置信度99%。同时挑取沙堡弱上单个菌落使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱系统（MALDI-TOF MS）鉴定为耳念珠菌，鉴定得分为2.23。

2 CHROmagar念珠菌显色平板颜色变化

平板置于28℃培养24 h和48 h后均呈乳白色，菌落在72 h后开始显现出浅粉红色，显色结果见图2。

图2 CHROmagar念珠菌显色培养基24、48、72 h显色结果

3 药敏试验结果

我们将测得的药敏试验数据和中国境内已报道的5例耳念珠菌（厦门2例XM1803、XM1805，北京3例C1921、C1922、BJCA001）[5-6]进行了对照，见表1，VITEK2药物敏感试验提示该例真菌对唑类及多烯类抗真菌药物均耐药，仅对5-氟胞嘧啶敏感。

4 耐药基因比对结果

为了解该菌的耐药机制，我们将与该菌有关的耐药基因序列[7]和参考序列进行了比对，敏感菌参考序列来自NCBI数据库，结果见表2。

5 系统发育树

对该菌进行一代测序鉴定后将基因测序结果输入BLASTN数据库进行比对，通过比对我们发现该菌株ITS区域基因序列与2017年南非上传至BLASTN数据库的分离株（KY656976）、2017年印度分离株（MK108049）、2022年印度分离株（ON331802）以及2022年印度分离株（ON331807）的基因序列具有100%的相似度。之后我们继续使用ITS区域的序列进行了系统发育树绘制用于分析该菌株的来源情况，我们选择了中国境内的已报道的5个菌株以及BLAST数据库中ITS序列相似性最高的9个菌株进行比对并绘制的系统发育树，见图3，比对显示我们分离的菌株（AHTLCA-001，以蓝色三角标注）和印度株（MK108049.1）亲缘性最为接近。

图3 安徽省分离的耳念珠菌与参考菌株的系统发育关系

6 毒力因素分析

我们使用全基因组测序结果做了KEGG ORTHOLOG（KO）注释，根据KO与通路的联系对其进行了KEGG代谢通路分类，获得了通路的分支柱状图，见图4，纵轴为参与到该代谢通路名称，横轴为注释到该通路下的基因数量。在与人类疾病相关基因通路中，感染类疾病基因表达数量最高，其次为肿瘤通路和神经退行性疾病通路。

图4 KEGG通路分类柱状图

讨 论

耳念珠菌可定植于普通病房和重症监护病房的环境中和患者皮肤上，在患者免疫功能良好的情况下不会引起感染。对于高风险人群如长期卧床、长期使用广谱抗菌药物、血管插管的患者、HIV感染患者尤为易感，本研究从血液中分离出耳念珠菌的患者患有糖尿病、高血压及长期卧床，易受到环境定植中的耳念珠菌感染。赵伟娜等[7]报道耳念珠菌极易在重症监护环境中传播，推测与共同使用的医疗设备上定植该菌有关，回顾本例患者病程我们发现，在该患者血培养检出耳念珠菌前两周，其邻床患者中段尿培养中也检出该菌，可能这两名患者之间存在交叉感染。

使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和真菌基因测序鉴定可更准确的鉴定菌种[8-10]，与黄小强等[11]报道不同的是，本例菌株使用VITEK2真菌鉴定系统也可准确鉴定到种，这可能与近年来VITEK2鉴定系统菌株库不断升级有关，但为了确保该菌与其易混淆的酵母样真菌如希木龙念珠菌，酿酒酵母和无名念珠菌更准确的鉴别，推荐实验室使用MALDI-TOF MS或分子生物学方法检测。

国际上关于耳念珠菌的耐药情况报道多指出其对唑类、多烯类和棘白菌素类抗真菌药物普遍耐药[12]，如CHOWDHARY等[13]在2020年报道的10株印度株中，所有分离株均对氟康唑耐药，40%对两性霉素B耐药，60%对5-氟胞嘧啶耐药，MAGOBO等[14]报道85株南非分离株药敏结果显示仅对唑类抗真菌药物呈现耐药性。因CLSI中目前尚未发布耳念珠菌药物敏感折点，所以在本研究中我们选择了使用白念珠菌的折点进行判断，结果显示其对唑类和两性霉素B耐药，对5-氟胞嘧啶敏感，在与北京报道的耳念珠菌（C1921，C1922）和厦门报道菌株（XM1803，XM1805）测试的药敏试验结果进行比对后发现，氟康唑、两性霉素B的折点相同，呈现多重耐药性，见表1。即便中国境内报道的第一株耳念珠菌（BJCA001）菌株对所有抗真菌药物敏感，然而在中国境内多重耐药的耳念珠菌也已经存在[15-16]。

表1 药敏试验结果比对

表2 耐药基因序列检测比对结果

有文献指出生物膜形成是真菌对唑类或多烯类药物耐药的原因，而外排泵相关蛋白（ABC转运蛋白）会在成熟的生物膜中显著出现，该例真菌的全基因组测序中检出其携带了ABC转运蛋白相关基因ABCB1基因，有上述原因得知，该例耳念珠菌对唑类药物耐药的原因为ERG11及CDR1基因突变，而生物膜的形成导致了对多烯类的耐药表现。

棘白菌素类耐药基因与FKS1基因的三个热点突变有关[17]。通过序列比对，我们未发现S639Y、S639P、S639F三个热点突变。因此，临床所使用的卡泊芬净应该对治疗真菌感染有效。然而在本次入院治疗之前，该患者处于浅昏迷状态长达5年。病程中患者长期卧床，反复出现呼吸系统、泌尿系统感染，基础情况差。因此对于该患者实施的气管切开、静脉留置管、导尿管、口鼻胃管、肠管等侵入性治疗措施无法停止。此外，患者的各器官功能衰竭在治疗后期逐步加重，患者年龄较大，机体代偿能力差。而念珠菌败血症的治疗效果与患者本身状况、耐受情况以及给药方式密切相关，因此该患者的念珠菌血流感染并未得到控制。

此外，念珠菌的致病因子多为酯酶、磷脂酶及溶血素等，全基因组测序结果显示，该菌株基因组中检出编码分泌型天冬氨酸蛋白酶（SAPs）相关基因16组，而SAPs主要为致病性念珠菌属分泌的一类可降解宿主蛋白质的胃蛋白酶样蛋白酶，这与该例耳念珠菌的高致病和高毒力有关。

医院感染防控方面，耳念珠菌药敏试验结论成为临床治疗相关感染的重要指标。除此之外，及早诊断和及时治疗由耳念珠菌引起的感染，可以明显改善患者的临床转归[18]。临床科室应针对性的使用有病原微生物实验室出具的药敏试验结果治疗。此外耳念珠菌可以在环境中存在7天依然有传染性[19]，具有高度持久性并难以准确鉴定和找到传播途径，故做好环境消毒成为预防耳念珠菌医院感染的重要途径之一，紫外线消毒和常用的表面消毒剂消毒能有效防止耳念珠菌在环境中的定植[20]，如有必要，需要更换或停止使用可接触患者的重复使用医疗设备，如血压监测绑带，水银体温表等。

本研究探讨了安徽省首次报道的血流感染耳念珠菌的相关信息。该株菌株具有多重耐药性。在中国境内报道的耳念珠菌中，绝大部分（19/21）属于南非分支进化株。基于ITS序列的系统进化树显示，本例菌株与印度分支进化株的亲缘关系最为接近。它属于国内已经报道的第二个南亚分离株。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突