1个新的ABO等位基因及其家系研究

赵佳 赵倩 苏蔓 胡光磊 郭霞 王振雷 陈莉

河北省血液中心，河北石家庄 050071

本实验室在对无偿献血者进行血型鉴定时发现1例ABO血型正反不符标本，进一步检测发现ABO等位基因新的变异组合，同时对先证者的家系进行了调查分析，更加证实了这一发现。现报道如下。

材料与方法

1 样本来源

先证者，女，32岁，无偿献血者，因ABO正反定型不符送本实验室确认。本研究所有受试者对进一步研究给予了书面知情同意。

2 血清学检查

按文献[1]采用试管法对先证者及其父亲、母亲、丈夫、儿子和两个弟弟进行ABO血型鉴定。试剂包括单克隆抗-A、抗-B标准血清（上海血液生物医药有限公司，批号20220102），抗-H试剂（上海血液生物医药有限公司，批号20210917），抗-A1试剂（荷兰Sanquin公司，批号8000456917），抗-AB试剂（德国CE-IMMUNDIAGNOSTIKA公司，批号：OABM101-4），反定型红细胞（美国Immucor公司，批号：115465C）。

3 基因组DNA提取

采用血液基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司，批号：Y1105）提取先证者及其父亲的DNA ，严格按照产品说明书进行操作。

4 基因测序

由北京九强生物技术股份有限公司对先证者及其父亲两个样本进行ABO E1-E7外显子测序。试剂包括浓缩dNTP Buffer（天津秀鹏生物技术股份有限公司，批号：k221217001），Taq酶（天津秀鹏生物技术股份有限公司，批号：A23980）。PCR仪采用杭州博日Life ECO，基因测序采用美国ABI公司的3730 DNA测序仪。测序结果与标准序列ABO*A1.01序列比较，确定突变位点。

结 果

1 ABO正反定型结果

先证者及其父亲、母亲、丈夫、儿子和两个弟弟的血型血清学检测结果如表1所示，先证者及其父亲均表现为正反定型不符。

表1 先证者及6名家系成员的血清学鉴定结果

2 样本测序结果

测序后结果与ISBT（International Society of Blood Transfuion，国际输血协会）网站“Names for ABO（ISBT 001）Blood Group Alleles”比对。根据血清学结果以及遗传学规律可推测出突变所发生的单链。先证者测序结果与ABO*A1.01序列比对发现单链1出现c.1A＞G；c.467C＞T；c.903C＞T共3个突变；单链2出现c.261delG共1个突变，与标准序列比对后判定为等位基因ABO*O.01.01。先证者父亲 测序结果与ABO*A1.01序列比对发现单链1出现c.1A＞G；c.467C＞T；c.903C＞T共3个突变；单链2 出现c.106G＞T；c.188G＞A；c.189C＞T；c.220C＞T；c.261delG；c.297A＞G；c.646T＞A；c.681G＞A；c.771C＞T；c.829G＞A共10个突变，与标准序列比对后判定为等位基因ABO*O.01.02（表2，图1）。

图1 先证者家系成员ABO表型、基因型

表2 先证者及其父亲的测序结果

结合血清学结果可以推测，先证者及其父亲的A基因链第1外显子发生了1A＞G的突变，第7外显子发生了467C＞T和903C＞T的突变，可见先证者突变的A基因遗传自父亲，测序峰图如图2所示。ISBT数据库中暂未检索到此种组合突变型的基因型。“Names for ABO（ISBT 001）Blood Group Alleles”显示ABO*Aw33可出现c.467C＞T和c.543G＞T的突变，ABO*Aw42可出现c.467C＞T和c.905A＞G的突变，ABO*Aw43可出现c.467C＞T和c.721C＞T的突变。

图2 先证者及其父亲ABO基因部分突变位点测序图

讨 论

ABO血型系统是人类第一个发现的也是最重要的红细胞血型系统，对于保障安全输血、组织器官移植和法医学鉴定等有着十分重要的意义。ABO血型系统的基因位点在第9号染色体9q34.1-q34.2，基因组全长为19.5 kb，包括7个外显子，有3个主要等位基因（A101、B101和O01）。ABO基因的A基因和B基因编码分别产生αl，3-N-乙酰氨基-D-半乳糖基转移酶和αl，3-D-半乳糖基转移酶，由其分别转移连接N-乙酰氨基半乳糖和半乳糖，从而形成A和B抗原[2-3]。同时，ABO血型鉴定时经常出现正反定型不一致，一般表现为抗原抗体的异常出现、减弱或消失，究其原因为DNA序列中的某个碱基发生了缺失、替代、插入、拼接点突变、等位基因杂交[4-5]等，从而产生了ABO亚型。

本文中的先证者为无偿献血者，因正反定型不符送本实验室确认，家系调查显示变异位点遗传自其父亲。根据血清学结果及遗传学规律，结合基因测序结果推测，先证者及其父亲ABO基因单链1在ABO*A1.01基础上产生1A＞G，467C＞T，903C＞T变异，编码出抗原减弱的A亚型。本研究中c.903C＞T属于同义突变，即突变前后表达的氨基酸一致，不影响基因的表达。而c.1A＞G和c.467C＞T变异导致第1位甲硫氨酸被缬氨酸取代（p.Met1Val）以及第156位脯氨酸被异亮氨酸取代（p.Pro156Leu），编码功能非常弱的A-糖基转移酶进而影响表型检测[6]。c.467C＞T是常见的A1多态性，即ABO*A1.02，A抗原在这些个体的红细胞膜上表达正常[7]，因此推测本文中A抗原减弱与c.467C＞T变异无直接关系，而与c.1A＞G变异相关。根据ISBT（International Society of Blood Transfuion，国际输血协会）网站“Names for ABO（ISBT 001）Blood Group Alleles”，ABO*Aw16可发生c.1A＞G变异。同时，有研究发现c.1A＞G变异也可见于ABO*Aw43[8]和ABO*A3.09[9]，该变异改变了第1外显子上编码αl，3-N-乙酰氨基-D-半乳糖基转移酶基因的起始密码子，导致翻译开始的位点推后，因而生成的A转移酶N端截短，同时A抗原表达明显减弱。另外，肖建宇等人推测ABO*Aw43等位基因的c.721C＞T变异也可导致A抗原减弱[10]。本研究发现的c.1A＞G、c.467C＞T、c.903C＞T突变型组合暂未在ISBT的“Names for ABO（ISBT 001）Blood Group Alleles”数据库中检索到。

通常，ABO亚型可通过血清学方法进行判断及确认，但部分亚型标本仍需要结合基因测序才能准确定型。因此在血清学实验中应注意观察正反定型时细胞凝集的强度及其一致性，必要时结合基因测序加以确认，以免误判，从而保证临床输血治疗的安全性。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突