环状RNA hsa_circ_0003056在肝癌细胞系中的表达及功能*

黄玲,丁艳,郁金红,张永臣,方安宁,严家来

(1.南京中医药大学附属南京医院＆南京市第二医院检验科,南京市公共卫生医疗中心,南京 210003;2.安徽医学高等专科学校 a.基础医学院;b.医学技术学院,合肥 230601)

原发性肝癌(primary hepatic carcinoma, PHC)是高发病率和高致死率癌症,我国约占全球50%以上的新发病例和死亡病例,其中肝细胞癌(HCC)约占PHC的84%～92%[1]。因缺乏灵敏、特异的筛查及诊断标志物,且治疗方法和疗效有限,患者的总体预后差[2]。多项研究[3-4]报道,非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)与肿瘤发生密切相关,尤其血浆中稳定表达的环状RNA (circular RNA,circRNA)被证实参与了肝癌发生、发展过程[5],可能成为新一代的生物学标志物或治疗靶点,目前已广泛用于人类疾病诊断、治疗、组织发育鉴定等各方面研究。本课题组前期实验表明,来源于磷脂酰肌醇转移蛋白β基因(PITPNB)的hsa_circ_0003056(又称为circPITPNB, hsa_circRNA_103191)在肝癌组织中呈差异表达[6],并建立了绝对定量检测血浆hsa_circ_0003056表达水平的方法[7]。本研究拟进一步用该方法检测过表达和敲减hsa_circ_0003056对HepG2、sk-hep-1肝癌细胞系生物学行为的影响,以期为临床诊断和治疗PHC提供新的靶点。

1 材料和方法

1.1细胞系、仪器与试剂 HepG2、sk-hep-1肝癌细胞系均为本实验室保存。hsa_circ_0003056过表达质粒和对照空载体pLC5-ciR由广州吉赛生物科技公司构建,hsa_circ_0003056慢病毒敲减干扰载体(pGMLV-SC5 RNAi)及其对照空载体(NC)由吉满生物科技(上海)公司构建。Opti-MEM和转染试剂Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司),MTT试剂(美国Sigma公司),CCK-8试剂、Transwell试验细胞培养板、matriGel胶(美国BD公司),Trypsin-EDTA消化液、细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC)/PI和细胞周期检测试剂盒(江苏凯基生物技术公司)。BD Calibur流式细胞仪(美国BD公司),KHB-ST-360酶标仪 (上海科华生物工程公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养及转染 取HepG2、sk-hep-1肝癌细胞系置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中,37 ℃、5%CO2培养箱内培养至对数生长期,待细胞融合度达90%时,根据Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书将重组质粒分别转染两种细胞系,试验设置以下4组:过表达空载体对照组(pLC5),hsa_circ_0003056过表达组(C3056),敲减空载体对照组(NC),hsa_circ_0003056敲减组(shRNA)。转染步骤:(1)转染前日,取5×105个细胞接种于6孔细胞培养板中,加入2 mL完全培养基继续培养,使转染前的细胞融合度达70%～90%。(2)在100 μL无血清培养基中加入3 μg质粒/5 μL siRNA(终浓度50 nmol/L),柔和混匀。(3)用100 μL无血清培养基稀释4 μL Lipofectamine 2000试剂,轻柔混匀,室温静置5 min。(4)将稀释好的质粒/siRNA与Lipofectamine 2000试剂混合,轻柔混匀,室温静置20 min,将200 μL质粒/siRNA-Lipofectamine复合物加入至含800 μL无血清培养基的细胞板中,轻柔振荡细胞培养板。(5)细胞在37 ℃、5% CO2培养箱中培养5～6 h,吸弃转染培养基,更换为完全培养基继续培养。收集转染后细胞进行相关功能试验。

1.2.2CCK-8 法检测的细胞增殖 取1.2.1中转染48 h后的细胞,置于96孔细胞培养板中,每孔加入100 μL细胞悬液(含2 000个细胞),按照CCK-8试剂及KHB-ST-360酶标仪说明书操作检测培养1、2、3 d时的吸光度(A450 nm)值,并计算细胞的相对增殖率。细胞增殖率计算公式:增殖率(同一样本)=第n天A450 nm值/第0天平均A450 nm值。细胞增殖抑制率计算公式:抑制率(同一时间点)=1-实验组增殖率/对照组平均增殖率。

1.2.3Transwell试验检测细胞迁移能力 取1.2.1中转染48 h后的各组细胞,用Trypsin-EDTA(0.25%∶0.02%)胰蛋白酶消化,1 500 r/min离心5 min,用无血清DMEM培养基重悬并计数,调整细胞密度为1×106/mL, 以100 μL/孔的细胞密度加入至Transwell小室的上室,在下室加入600 μL完全培养基,置于37 ℃、5%CO2培养箱温育24 h。取出小室,用棉签擦去上室的细胞,4%多聚甲醛固定15 min,清洗后结晶紫染色10 min,光学显微镜下拍照并计数穿过细胞数。

1.2.4Transwell试验检测细胞侵袭能力 4 ℃溶解Matrigel基质胶过夜,用预冷的无血清培养基以1∶3的体积比稀释,取40 μL Matrigel基质胶,加入至预冷的Transwell试验小室中,37 ℃温育2 h使基质胶凝固。吸弃小室中多余的液体,并在上室、下室分别加入100 μL和600 μL无血清培养基,37 ℃平衡过夜。取转染48 h后的各组细胞,用Trypsin-EDTA(0.25%∶0.02%)胰蛋白酶消化,1 500 r/min离心5 min,无血清DMEM培养基重悬,计数1×105个细胞,用100 μL无血清DMEM培养基重悬,加入至Transwell试验小室的上室,在下室中加入600 μL完全培养基。温育24 h后,取出小室,用棉签拭去上室的细胞。4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗涤,结晶紫染色10 min,PBS洗涤,光学显微镜下拍照并计数穿膜细胞数。

1.2.5流式细胞仪检测细胞周期 取上述转染48 h后的各组细胞,用Trypsin-EDTA(0.25%∶0.02%)胰蛋白酶消化,收集1×106个细胞。检测步骤:(1)细胞固定:1 500 r/min离心5 min收集细胞,弃上清,用预冷PBS洗涤2次,加入预冷70%乙醇,置于4 ℃固定过夜。(2)细胞染色:离心并收集细胞,PBS洗涤,分别加入500 μL PBS,50 μg/mL溴化丙锭(PI),100 μg/mL RNase A,0.2% Triton X-100试剂,4 ℃避光温育30 min。(3)流式细胞分析:记录激发波长488 nm处PI红色荧光,计数2～3万个细胞,结果用ModFit细胞周期拟和软件(美国 Verity Software House公司)分析。

1.2.6流式细胞仪检测细胞凋亡水平 收集上述转染48 h后的各组细胞, 1 500 r/min离心5 min,弃上清,用PBS重悬细胞并计数,离心后弃上清,加入预冷的1×结合液,调节细胞密度至1×106/mL,取0.5 mL细胞悬液(5×105个),按照细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V-FITC)及BD Calibur流式细胞仪说明书进行细胞凋亡检测。结果判读:活细胞(AnnexinV-/PI-);早期凋亡细胞(AnnexinV+/PI-);凋亡晚期细胞和坏死细胞 (AnnexinV+/PI+),最终凋亡统计结果为早凋、晚凋及死细胞总数。

2 结果

2.1CCK-8法检测各组细胞增殖能力 检测结果表明,与对照组(3.20±0.04)比较, hsa_circ_0003056过表达组在第3天时sk-hep-1细胞的增殖能力(3.53±0.04)显著升高(t=10.63,P<0.01);而hsa_circ_0003056敲减组的增殖能力(2.90±0.03)显著降低(t=19.82,P<0.01)。此外,与对照组(5.90±0.10)相比, hsa_circ_0003056过表达组在第3天时HepG2细胞的细胞增殖数(6.57±0.09)显著升高(t=8.84,P<0.01),而hsa_circ_0003056敲减组(4.93±0.27)显著降低(t=6.32,P<0.01)。见图1。

注:A,sk-hep-1细胞生长曲线,B,HepG2细胞生长曲线;pLC5,过表达空载体对照;C3056,hsa_circ_0003056过表达质粒;NC,shRNA对照;shRNA,hsa_circ_0003056敲减质粒;a,与pLC5比较,P<0.05; b,与NC比较,P<0.05。

2.2hsa_circ_0003056促进sk-hep-1和HepG2细胞迁移及侵袭能力 与pLC5对照组的迁移数[(217.67±6.51)个]和侵袭数[(165.67±3.79)个]比较,sk-hep-1细胞中hsa_circ_0003056过表达组的迁移数[(301.67±7.23)个]和侵袭数[(252.67±22.19)个]均显著增加(t分别为14.95,6.70,P<0.01);与NC组的迁移数[(257±6.24)个]和侵袭数[(188±6.08)个]比较,敲减组的迁移数[(127.33±5.13)个]和侵袭数[(110.67±4.73)个]均显著降低(t分别为27.79,17.39,P<0.01)。此外,与pLC5对照组的迁移数[(11.67±2.31)个]和侵袭数[(9.33±2.52)个]比较,sk-hep-1细胞中hsa_circ_0003056过表达组的迁移数[(26.67±8.96)个]和侵袭数[(15.67±2.89)个]均显著增加(t分别为2.81,2.86,P<0.05);而与NC组的迁移数[(6.33±1.53)个]和侵袭数[(9.33±2.08)个]比较,敲减组的迁移数[(4.67±1.53)个]和侵袭数[(2.67±0.58)个]均显著降低(t分别为1.34和5.35,P值分别为0.25和0.006)。见图2。

注:A,Transwell试验检测迁移及侵袭结果(结晶紫染色,×200);B,细胞迁移及侵袭柱状图;pLC5,过表达空载体对照;C3056,hsa_circ_0003056过表达质粒;NC,shRNA对照;shRNA,hsa_circ_0003056敲减质粒;a,与pLC5比较,P<0.05;b,与NC比较,P<0.05。

2.3hsa_circ_0003056加快sk-hep-1和HepG2细胞周期进程并促进细胞增殖 流式细胞术检测过表达和敲减hsa_circ_0003056后对sk-hep-1和HepG2细胞周期的结果表明,在sk-hep-1细胞中,过表达组(46.18%)相较对照组G1期细胞比率(54.64%)显著降低,而干扰组(70.29%)较其对照组G1期细胞比率(56.93%)显著增加,差异均有统计学意义(P<0.05);同样,在HepG2细胞中,过表达组(43.2%)相较对照组G1期细胞比率(49.73%)显著降低,干扰组(59%)较其对照组G1期细胞比率(50.63%)显著增加,差异亦有统计学意义(P<0.05)。见图3。

2.4hsa_circ_0003056降低sk-hep-1和HepG2细胞凋亡水平 在sk-hep-1和HepG2细胞中过表达和敲减hsa_circ_0003056后,流式细胞术检测细胞凋亡水平结果表明,在sk-hep-1细胞中,过表达组细胞凋亡率(3.42%)较对照组(7.24%)显著降低,敲减组细胞凋亡率(10.87%)较其对照组(7.15%)显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。同样,在HepG2细胞中,过表达组细胞凋亡率(1.09%)较对照组(8.08%)显著降低,敲减组细胞凋亡率(14.09%)较其对照组(9.92%)显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

注:pLC5,过表达空载体对照;C3056,hsa_circ_0003056过表达质粒;NC,shRNA对照;shRNA,hsa_circ_0003056敲减质粒。

3 讨论

继miRNA及LncRNA之后,近年来circRNAs的功能及机制研究相对比较热门。与线性的miRNA相比,circRNA除了具有较多的结合位点、较高的表达水平以及在外周血中稳定表达外,其在多种肿瘤的发生、发展过程中具有重要的临床价值,具有潜在成为肿瘤标志物的可能性[8]。在肝癌组织中差异表达的circRNA相对较少,有学者通过比较肝癌组织和癌旁组织中差异表达的circRNA谱,发现hsa_circ_0005075可能成为肝细胞癌的一种潜在的生物学标志物,在肝癌发生与转移中发挥重要的作用[9]。另有研究证实,肝癌组织中高表达的hsa_circ_PVT1[10]、hsa_circ_0001394[11]、circRNA-100338[12]、hsa_circRNA_104348[13]等与患者肿瘤大小、TNM分期、生存率及预后密切相关。此外,还有学者发现在肝癌组织中呈低表达的circZKSCAN1[14]、CircMEMO1[15]等亦与疾病发生、发展有关。

本课题组通过前期实验证实[6],与癌旁组织比较,环状RNA hsa_circ_0003056在肝癌患者的肿瘤组织中呈低表达,只有少数患者的该指标变化不明显;与体检健康者比较,不同肝癌患者血浆中环状RNA hsa_circ_0003056的表达水平存在较大的差异,但总体上无统计学意义。此外,hsa_circ_0003056上调组的预后与下调组差异不显著,推测可能与纳入的标本个体差异性有关。本研究进一步分析了hsa_circ_0003056在肝癌细胞系中的功能,结果证实过表达hsa_circ_0003056能促进肝癌细胞增殖、迁移和侵袭,同时可以加快细胞周期进程,促进细胞增殖,降低细胞凋亡;而敲减hsa_circ_0003056可抑制细胞增殖、迁移侵袭,阻滞细胞周期进程,抑制细胞增殖,同时促进细胞凋亡。推测原因:(1)肝癌细胞中hsa_circ_0003056轻度升高,但肝癌组织中占40%的其他表达该分子且丰度高的成分如脂肪组织、胆管、枯否细胞(Kupffercells,KC)等被肝癌细胞相对抑制生长,造成肝癌组织的混合物中hsa_circ_0003056的表达水平总体呈下降趋势。(2)进行功能试验的肝癌细胞系与肝脏组织不同,细胞系中hsa_circ_0003056的表达丰度较低,与正常肝细胞系L02相比,hsa_circ_0003056在HepG2和sk-hep-1细胞系中均呈高表达,而在低转移人肝癌细胞系MHCC97-L和Huh7细胞系呈低表达,表明不同肝癌细胞系中hsa_circ_0003056的表达量也不同。此外,不同患者血浆中hsa_circ_0003056的表达水平也各不相同,表明肝癌的异质性较大,患者外周血中该分子可能来源于不同组织,同一组织中不同细胞表达量也不同,临床应用hsa_circ_0003056进行个体化诊断治疗还有许多需要研究的地方。

根据ceRNA网络预测理论,circRNA的表达水平与目的基因呈正相关,生物信息学GO和KEGG分析亦表明,hsa_circ_0003056可以通过靶向miR-211-5p/miR-204-5p/miR-9-3等“海绵”样作用调节下游基因。推测hsa_circ_0003056与其母基因PITPNB之间可能存在竞争抑制关系。本研究发现hsa_circ_0003056表达失调,可能增加PHC侵袭及转移,但还需要进一步的实验验证。综上所述, hsa_circ_0003056可促进肝癌细胞系HepG2和sk-hep-1细胞增殖、迁移及侵袭,加快细胞周期进程,降低细胞凋亡。