蛋白激酶C 参与调控小鼠脑皮层神经元神经调节蛋白1 表达的初步研究

田佳，陈晶，陆萍，张越，梁洪宇

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

神经调节蛋白1（Neuregulin 1，NRG1，Nrg1）在神经发育和突触可塑性中发挥重要作用[1-3]，其异常表达也与许多神经精神疾病有关[4]，如精神分裂症[5-8]、中风[9-10]、抑郁症[11-12]、阿尔茨海默病[13-14]、肌萎缩性脊髓侧索硬化症[15-16]、双相情感障碍[17-18]等。根据5'端调控序列和铰链可变区可分为六种亚型（Ⅰ-Ⅵ），这些亚型在不同组织中的分布和表达水平不同（其中Ⅰ-Ⅲ型表达量较大），功能也不同[1，4，6，19-21]。Ⅰ亚型Nrg1在精神分裂症患者的前额叶皮层增加，可影响工作记忆[22-23]。

研究表明，向小鼠体内注射海人藻酸或强迫运动时，小鼠脑皮层组织的Nrg1 表达增加[24-25]。用海人藻酸或高浓度氯化钾刺激体外培养的皮层神经元可使Nrg1 表达增加[20]。然而，尚不清楚通过γ－氨基丁酸（GABA）受体阻断剂荷包牡丹碱（bicuculine，bic）引起的神经活动是否也能增加Nrg1 及其主要亚型的mRNA 表达。如果可以，它与氯化钾诱发的神经活动引起的Nrg1 及其主要亚型表达增加的机制是否相同，研究试图解释这些问题，这有助于理解Nrg1及其主要亚型的功能，从而为神经精神疾病的治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF 级C57BL/6 小鼠，单位伦理委员会的批准文件号（SMKXJSXY2022010）。

1.1.2 主要药品和试剂

DMEM-F/12 培养基、胎牛血清、神经元基础培养基购自Gibco 公司。多聚赖氨酸、阿胞糖苷、青霉素、链霉素、氯化钾、荷包牡丹碱、KN62、U0126、KT5720、Bis I 购 自Sigma-Aldrich 公 司。RNAiso Plus、PrimeScript RT Reagent Kit、SYBR Ex Taq 购自Takara 公司。所用引物于上海生物工程公司合成。

1.1.3 主要仪器

超净工作台（上海博讯）、二氧化碳培养箱（Thermo Scientific）、荧光定量PCR 仪（Agilent Technologies Stratagene Mx3005P）。

1.2 方法

1.2.1 原代皮层神经元培养

分离1 日龄的乳鼠脑皮层，在含有0.05%胰蛋白酶的培养基（DMEM-F/12）中37 ℃消化10 min。皮层神经元经500 g 离心10 min 后重新悬浮，再以高密度（8×105）接种于经多聚赖氨酸（50 mg·m L-1）包被的12 孔板上。培养基成分为DMEM-F/12、10%胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素（100 U·m L-1）。5 h 后，将培养基换为添加B27 的神经元基础培养基。3 d 后，加入5 mM 阿胞糖苷（AraC）以去除增殖的神经胶质细胞。置于37 ℃含5% CO2的培养箱中培养，每2 d更换一半体积的培养基[20]。实验在培养14 d 的神经元上进行。所有实验均按照实验动物管理条例进行。

1.2.2 药物处理

在活动依赖性的Nrg1 表达分析实验中，分别用氯化钾（50 mM）或荷包牡丹碱（50 μM）处理培养14 d的小鼠皮层神经元，0.5、1、3 和6 h 后提取RNA。在活动依赖性的Nrg1 表达机制探索实验中，用氯化钾或荷包牡丹碱刺激前30 min 向体外培养的神经元培养基中分别加入U0126（10 μM）以抑制丝裂原活化蛋白激酶，KT5720（10 μM）以抑制蛋白激酶A，KN62（10 μM）以抑制Ca2+/钙调蛋白激酶，bis I（100 nM）以抑制蛋白激酶C。对于溶解在二甲基亚砜（DMSO）中的药品，二甲基亚砜的最终浓度<0.1%。

1.2.3 RNA 提取和cDNA 合成

氯化钾或荷包牡丹碱刺激神经元后，按鞠憬等[26]报道的方法，用RNAiso Plus 分离总RNA，1 μg RNA通过PrimeScript RT Reagent Kit 试剂盒用于合成第一链cDNA。

1.2.4 实时定量聚合酶链反应

所用引物按参考文献［20］设计如下，NRG1-F：ACCAGCCATCTCATAAAGTGCG，R：TTGACGGGTTTGACAGGTCC；Ⅰ型NRG1 F：TCATCTTCGGGCGA GATGTCTG，R：CTCCTGGCTCTTCATTTCTTTCA；Ⅱ型NRG1 F：GAGACTGGCCGCAACCTCA，R：TGACTCCTGGCTCTTCATTTCTTT；Ⅲ型NRG1 F：GGACCCCTGAGGTGAGAACA，R：CAGTCGTCCATGTCGATGTGG。β-actin-F：CAGATGTGGATCAGCAAGCAGG，R：TTGTCAAAGAAAGGGTGTAAAACG。

在荧光定量PCR 仪iCycler （Agilent Technologies Stratagene Mx3005P）中使用SYBR 预混Ex Taq进行实时RT-PCR。用β-actin 做内参基因，2-ΔΔCt法分析靶基因的mRNA 表达。

1.2.5 统计分析

采用SPSS 20.0 进行统计分析。两组数据采用t检验分析，多组数据进行单因素方差分析。结果以均数±标准误表示。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 神经活动依赖的Nrg1 及其主要亚型的表达

用氯化钾刺激体外培养的小鼠皮层神经元6 h时，Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 的表达增加（图1a，1b），而Ⅱ型和Ⅲ型Nrg1 的表达不变（图1c，1d）。荷包牡丹碱刺激6 h 时，Nrg1 和I 型Nrg1 的表达增加（图2a，2b），Ⅱ型和Ⅲ型的表达不变（图2c，2d）。

图1 氯化钾诱发的神经活动依赖的Nrg1 及其主要亚型表达Fig.1 The expression of KCl-induced activity-dependent Nrg1 and its main isoforms

图2 荷包牡丹碱诱发的神经活动依赖的Nrg1 及其主要亚型表达Fig.2 Expression of bicuculline-induced activity-dependent Nrg1 and its main isoforms

2.2 PKC 参与氯化钾诱导的皮层神经元Nrg1 和1亚型Nrg1 mRNA 表达的上调

在体外培养14 d 的小鼠皮层神经元的培养基中分别加入Ca2+/钙调蛋白激酶（CaMK）抑制剂KN62，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制剂U0126 ，蛋白激酶A（PKA）抑制剂KT 5720（KT）或蛋白激酶C（PKC）抑制剂bisⅠ（Bis），再加入氯化钾刺激6 h 后，收集神经元提取RNA。如图3a 和图3b，实时定量聚合酶链反应结果发现KN62（KN）对氯化钾刺激诱发的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 mRNA 表达没有影响。因此，氯化钾诱导的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 mRNA 的表达增加不依赖于Ca2+/钙调蛋白激酶。加入丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制剂U0126 或蛋白激酶A（PKA）抑制剂KT 5720（KT）对氯化钾诱导的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 mRNA 表达没有影响，但蛋白激酶C（PKC）抑制剂bisⅠ（Bis）降低了氯化钾诱导的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 mRNA 表达。

图3 氯化钾诱发的Nrg1 及1 亚型Nrg1 表达增加需要PKCFig.3 KCl-induced Nrg1 and Nrg1 type I expressions requires PKC

2.3 CAMK，MAPK 和PKC 通路参与荷包牡丹碱诱导的皮层神经元Nrg1 和1 亚型Nrg1 mRNA表达的上调

如图4a 和图4b，Ca2+/钙调蛋白激酶（CaMK）抑制剂KN62（KN）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制剂U0126 或蛋白激酶C（PKC）抑制剂bis Ⅰ（Bis）均可降低荷包牡丹碱诱导的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 的mRNA 表达，但蛋白激酶A（PKA）抑制剂KT 5720（KT）对荷包牡丹碱诱导的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 的mRNA 表达无影响。

3 讨论

为了探讨神经活动是否可以引起Nrg1 及其主要亚型的表达变化，在体外培养的小鼠皮层神经元中，采用氯化钾和荷包牡丹碱两种不同的方式诱发神经活动。研究发现活动依赖性表达变化的基因，如c-fos 可在神经活动诱导后60 min 内表达增加[27]，而脑源性神经营养因子（BDNF）可在神经活动诱导后360 min 表达增加[28]。首先，用氯化钾（50 mM）引发的快速去极化刺激体外培养14 d 的小鼠皮层神经元，在0.5、1、3 和6 h 分别收集神经元，采用实时定量聚合酶链反应分析Nrg1 及其主要亚型mRNA 水平的时间依赖性变化。发现高浓度氯化钾刺激体外培养的皮层神经元6 h 时Nrg1 和Ⅰ亚型Nrg1 表达增加，这支持了前人报道[20]，而其他两种主要亚型Ⅱ和Ⅲ型Nrg1 的表达保持不变。接下来又用GABA 受体的拮抗剂荷包牡丹碱（50 μM）处理神经元，GABA受体的拮抗剂荷包牡丹碱可以通过去除GABA 能抑制导致神经元的活性增强，从而触发了另一种神经活动[29]，同样也发现了荷包牡丹碱刺激可引起Nrg1和I 型Nrg1 表达增加，但不能引起Ⅱ型和Ⅲ型Nrg1的表达变化。综上，Nrg1 和I 型的表达具有神经活动依赖性。

进而探究神经活动依赖的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 mRNA 表达的调控机制。有研究表明：Ca2+/钙调蛋白激酶（CaMK）在转录因子CREB 的快速磷酸化中起作用[30-31]，假设Ca2+/钙调蛋白激酶（CaMK）可能介导Nrg1 和Ⅰ亚型Nrg1 的神经活动依赖性的增加。用Ca2+/钙调蛋白激酶（CaMK）抑制剂KN62 孵育体外培养14 d 的皮层神经元，然后用氯化钾刺激后分析Nrg1 和Ⅰ亚型Nrg1 mRNA 的表达水平。发现Ca2+/钙调蛋白激酶（CaMK）抑制剂KN62 不能降低氯化钾诱导的Nrg1 和Ⅰ亚型Nrg1 mRNA 表达。因此，氯化钾诱导的Nrg1 和Ⅰ亚型Nrg1 mRNA 的表达增加不依赖于Ca2+/钙调蛋白激酶（CaMK）。探讨其他典型的神经元信号分子，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、蛋白激酶A（PKA）和蛋白激酶C（PKC）[32]是否与氯化钾刺激引起的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 mRNA 表达增加有关。发现丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制剂U0126或蛋白激酶A（PKA）抑制剂KT5720 预处理对氯化钾诱导的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 mRNA 表达没有影响，但蛋白激酶C（PKC）抑制剂bisⅠ（Bis）可降低氯化钾诱导的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 mRNA 表达。综上，氯化钾诱导的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 mRNA 的表达是由PKC 介导的，而不是CaMK、MAPK 或PKA。

用类似的方法探讨荷包牡丹碱诱导的Nrg1 和Ⅰ型mRNA 表达上调的机制，CaMK 激酶抑制剂KN62（KN）、MAPK 抑制剂U0126 或PKC 抑制剂bisⅠ（Bis）降低了荷包牡丹碱诱导的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1的mRNA 表达，但PKA 抑制剂KT5720 对荷包牡丹碱诱导的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 的mRNA 表达无影响。这提示PKC、CaMK 和MAPK 参与了荷包牡丹碱诱导的Nrg1 和Ⅰ型Nrg1 mRNA 的表达增加。

Ca2+/钙调蛋白激酶（CaMK）是一种丝氨酸/苏氨酸特性的蛋白激酶，可被钙/钙调蛋白复合物所调节。其中钙调蛋白激酶Ⅱ（CaMK Ⅱ）具有多功能，在多种生物反应中起重要作用。脑中约有1%～2%的钙调蛋白激酶Ⅱ，在神经系统中的主要作用包括神经递质的分泌，转录因子的调节和糖原代谢等。蛋白激酶A激活后，催化亚基释放，从而催化ATP 末端的磷酸基团转移到蛋白底物的丝氨酸或苏氨酸残基上，进而导致底物活性的变化。在神经元中蛋白激酶A（PKA）参与学习记忆相关的基因表达，其机制是通过激活CREB，CREB 结合cAMP 反应元件，从而改变基因的转录和蛋白质的合成。此过程需要较长的时间（从几个小时到几天）。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一组丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，它能被不同类型的细胞外刺激（如神经递质、细胞因子、激素、应激等）激活，是信号入细胞核的重要传递者。在未受刺激的细胞内，MAPK 为静止状态。当细胞受到刺激后，MAPK 可被激活，发生逐级磷酸化。蛋白激酶C（PKC）也是具有多种功能的酶。在未受任何刺激的细胞中，蛋白激酶C 主要以非活性构象分布在细胞质中，遇第二信使时与细胞膜结合，进而参与生物化学反应调控；蛋白激酶C 也可以作用于细胞核内的转录因子，参与基因表达的调控。可通过两种主要的途径参与基因表达的调控。一种是通过激活磷酸化的级联反应，使丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）发生磷酸化，而磷酸化的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）又可将基因调节蛋白Elk-1 磷酸化，使之激活。Elk-1 激活后与血清反应元件（SRE）结合，进而与血清反应因子（SRF）共同调节基因表达。另一种可能参与基因表达调控的方式是其磷酸化后激活抑制蛋白IκB，释放基因调节蛋白NF-κB，使之进入细胞核从而激活特定的基因转录[30-32]。根据上述结果，蛋白激酶C 参与神经活动依赖的Nrg1 及1 型Nrg1 的表达增加可能是通过NFκB 途径，有待进一步研究。

在中枢神经系统发育过程中，单个神经元可接受数千个突触的输入，神经活动诱发相关的基因表达，从而使细胞对外界刺激作出反应。神经活动依赖的基因突变与人类认知功能障碍有关，在神经发育异常或精神障碍的人群中，需要环境信息的输入（如语言交流）或依赖环境的适应（如学习）活动通常出现异常，这表明神经活动依赖性的神经元适应的失调可能是这些疾病的发病机制。神经调节蛋白1（Neuregulin 1，Nrg1）在神经系统发育、突触可塑性以及神经精神疾病中发挥重要作用，对缺血性脑损伤具有保护作用[9-10]。小鼠前额叶皮层中神经调节蛋白1 下调可产生抑郁样行为[11]，神经调节蛋白1 可介导氯胺酮的急性、持续抗抑郁作用[12]，过表达I 型神经调节蛋白1 的基因治疗，可以保护肌萎缩性脊髓侧索硬化症小鼠脊髓中的运动神经元，从而改善后肢肌肉的运动功能，延迟临床疾病发生[16]。血浆的神经调节蛋白1 可作为阿尔茨海默病临床检测的标志物[14]。精神分裂症患者的前额叶皮层I 亚型神经调节蛋白1 表达增加[22]，在基因治疗精神分裂症以及与发育相关的精神疾病方面具重大潜力[33]。研究发现神经调节蛋白1 以及1 型神经调节蛋白1 的mRNA 表达是神经活动依赖性的。蛋白激酶C（PKC）同时参与了氯化钾和荷包牡丹碱诱发的两种不同的神经活动依赖的神经调节蛋白1 和I 型神经调节蛋白1 的mRNA 表达增加，其蛋白表达水平有待进一步探索。这将有助于深入了解大脑的正常发育和可塑性，并理解认知功能障碍相关疾病的病因，可为这些神经精神疾病的治疗提供新思路。

哺乳动物和人的大脑由许多具有不同解剖学、电生理学和转录组特征的细胞类型组成。用RNA 测序技术可高通量的识别胚胎兴奋性或抑制性神经元的神经活动依赖的转录产物，在刺激后的60 min 内，兴奋性和抑制性神经元表达的基因还包括活动依赖性转录因子如Egr1、Fos、Fosb、Npas4 等[34]。使用核糖体标记技术从体内特定神经元亚型中分离的mRNA，可揭示不同亚型的抑制性神经元〔如前脑的小白蛋白（PV）中间神经元、生长抑素（SST）中间神经元和血管活性肠肽（VIP）中间神经元〕中独特的神经活动依赖性的基因表达[35-37]。神经调节蛋白1 在不同脑区（皮层、海马、杏仁核等）、不同细胞类型（如PV 中间神经元、SST 中间神经元和VIP 中间神经元等）、不同时间的表达比较复杂，可能与其不同的功能有关，需要进一步研究。

4 结论

在体外培养的小鼠皮层神经元中，氯化钾和荷包牡丹碱两种神经活动可引起Nrg1 及1 型Nrg1 的表达增加。PKC 参与氯化钾诱导的小鼠皮层神经元Nrg1 和1 亚型Nrg1 mRNA 表达的增加，而CAMK，MAPK 和PKC 参与荷包牡丹碱诱导的小鼠皮层神经元Nrg1 和1 亚型Nrg1 mRNA 表达的增加。