骨肉瘤组织RRBP1表达及其对细胞生物学特征的影响

杨玉强 全晓丽 王刘玉 鲜文峰 杨 红

（1.南阳市第二人民医院骨一科，河南 南阳 473000；2.郑州大学第一附属医院肿瘤内科，河南 郑州 450001）

骨肉瘤是儿童和青少年人群高发的原发性间叶组织恶性肿瘤，病死率较高[1]。尽管针对骨肉瘤的诊疗策略不断优化，但对于发生转移的患者疗效仍有限，患者复发率和死亡率依然较高[2]。目前，骨肉瘤发病机制尚不完全清楚。有研究结果显示，内质网应激蛋白参与了骨肉瘤细胞的恶性增殖[3]。还有研究发现，内质网应激可诱导骨肉瘤细胞凋亡和自噬[4]。核糖体结合蛋白1（ribosome-binding protein 1，RRBP1）作为一种粗面内质网蛋白，在新生蛋白跨膜易位和内质网应激中发挥重要作用[5]，其在多种恶性肿瘤组织中表达异常[6]，与前列腺癌预后密切相关[7]，也是判断食管癌患者预后的潜在生物标志物[8]。但RRBP1是否参与了骨肉瘤的发生、发展尚不明确。本研究拟通过检测骨肉瘤组织中RRBP1蛋白的表达情况，分析其在不同临床病理参数骨肉瘤患者中表达的差异，并观察下调其表达对骨肉瘤细胞特性的影响。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2014年6月—2020年6月在南阳市第二人民医院和郑州大学第一附属医院行手术治疗的骨肉瘤患者91例，其中男52例、女39例，年龄（19.62±8.15）岁。所有患者经病理学检查确诊为骨肉瘤，排除继发性骨肿瘤。组织学类型：纤维母细胞型15例，软骨母细胞型17例，骨母细胞型43例，混合型16例；肿瘤部位：四肢骨72例，中轴骨19例；Enneking分期：ⅡA期28例，ⅡB～Ⅲ期63例；发生远隔转移42例。另选取南阳市第二人民医院骨科行手术治疗且排除骨肿瘤的患者45例，其中男27例、女18例，年龄（20.05±9.05）岁。骨肉瘤患者和骨科手术患者之间性别和年龄差异均无统计学意义（P>0.05）。本研究经南阳市第二人民医院伦理委员会批准（NYSDERMYY20130809113），所有患者均知情同意。

1.2 主要仪器和试剂

兔抗人RRBP1多克隆抗体（克隆号bs-6574R，北京博奥森生物公司），免疫组化试剂盒和配套试剂（上海研卉生物公司），人骨肉瘤细胞系U-2OS（上海通派生物公司），Dulbecco改良Eagle培养基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）、胎牛血清和青霉素-链霉素（美国Gibco公司）。RRBP1干扰序列（si-RRBP1）和对照序列（si-NC）由上海捷兰生物公司合成，Trizol试剂和Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司），逆转录和扩增试剂盒（日本TaKaRa公司）。RRBP1和内参[甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）]引物由生工生物（上海）股份有限公司合成。CCK-8试剂盒（上海碧云天公司），Transwell小室（美国Corning公司），基质胶（美国BD公司）。StepOne Plus实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司），GellDoc XR+凝胶电泳分析系统、xMark酶标仪（美国伯乐公司），DP50显微镜（日本Olympus公司）。

1.3 骨肉瘤组织和正常骨组织RRBP1蛋白表达的检测

分别收集骨肉瘤患者和骨科手术患者的骨肉瘤组织和正常骨组织样本，石蜡包埋，以4 µm厚度切片，经烤片、脱腊、脱水、透明至水，浸入pH值为6.0的柠檬酸钠液行抗原修复，用3% H2O2灭活内源性过氧化物酶，磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）冲洗3次。滴加兔抗人RRBP1抗体（1∶800稀释），4 ℃孵育过夜，PBS冲洗，滴加二抗，孵育60 min，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，透明、封片观察。在光学显微镜的高倍镜下随机取5个视野。按文献[9]方法进行评分。1）染色评分：无染色为0分，淡黄为1分，棕黄为2分，棕褐为3分；2）染色细胞百分比评分：<5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。以染色评分与染色细胞百分比评分的乘积为最终得分，≥1分为阳性。

1.4 病例随访

从手术当日开始，每3个月对患者电话随访1次，每6个月来院复查1次，对于未按时复查者，进行电话随访。随访截止日期为2021年12月，记录患者生存情况。

1.5 细胞学实验

1.5.1 细胞培养和处理

将U-2OS细胞置于含10%胎牛血清的DMEM中，在5% CO2、37 ℃条件下培养。当细胞融合度≥80%时，消化，传代。将对数生长期的细胞接种于6孔板中，待细胞密度>70%时，用Lipofectamine 2000转染不同序列。1）si-RRBP1组：转染RRBP1干扰序列5'-GCAAGCCAGGATGGATATTTA-3'；2）si-NC组：转染阴性对照序列5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'；3）空白对照组：仅加入转染试剂。处理后继续培养48 h。以常规培养的U-2OS细胞作为对照。

1.5.2RRBP1 mRNA表达的检测

取U-2OS细胞和si-RRBP1组、si-NC组和空白对照组细胞，加入裂解液，采用Trizol试剂提取细胞总RNA。用逆转录试剂将RNA逆转录为互补DNA（complementary DNA，cDNA），以cDNA为模版，采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTqPCR）扩增。RRBP1 mRNA上游引物为5'-AACCTAATGGGAAGATACCTGA-3'，下游引物为5'-CATGGCTGGAACTGTGGC-3'；GAPDH上游引物为5'-CTGAACGGGAAGCTCACTGG-3'，下游引物为5'-TGAGGTCCACCACCCTGTTG-3'。反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，58 ℃30 s，70 ℃ 30 s，36个循环。采用2-ΔΔCt法计算RRBP1 mRNA相对表达量。

1.5.3 RRBP1蛋白表达的检测

采用免疫印迹法检测RRBP1蛋白的表达。取U-2OS细胞和si-RRBP1组、si-NC组和空白对照组细胞，加入蛋白裂解液，离心后取上清，用二喹啉甲酸（bicinchonic acid，BCA）试剂盒测定总蛋白浓度。取50 µg蛋白，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转至聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉封闭120 min，加入兔抗人RRBP1多克隆抗体（1∶600稀释），4 ℃过夜孵育，三羟甲基氨基甲烷-吐温缓冲液（trishydroxymethyl aminomethane-Tween，TBST）冲洗3次，加入二抗，室温孵育120 min，TBST冲洗3次，加入显色剂，以GAPDH为内参，采用Image J软件（美国国立卫生研究院）分析条带的灰度值，计算相对表达量。

1.5.4 细胞增殖实验

取si-RRBP1组、si-NC组和空白对照组细胞，离心后取沉淀，用培养液复悬，接种于96孔板，密度为2×103个/孔，继续培养，分别于培养12、24、48、72和96 h时加入20 µL CCK-8溶液，继续培养2 h，采用xMark酶标仪检测各孔吸光度（A）值。

1.5.5 细胞迁移实验

取si-RRBP1组、si-NC组和空白对照组细胞，胰蛋白酶消化，用无血清培养液制备单细胞悬液，密度为2.5×105个/mL，将200 µL单细胞悬液加入Transwell小室的上室，下室加入600 µL含10%胎牛血清的培养液，培养24 h，固定，1%结晶紫染色25 min，在DP50显微镜下观察，随机取5个高倍镜视野（按左上、左下、中央、右上、右下选择）计数穿膜细胞数，实验重复3次。

1.5.6 细胞侵袭实验

用培养液稀释基质胶，平铺于Transwell小室的上室，风干备用。其余实验步骤同“细胞迁移实验”。

1.6 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计分析。呈正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用LSD-t检验。计数资料以例或率表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier生存曲线和Log-rankχ2检验评估骨肉瘤患者的生存情况。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨肉瘤组织和正常骨组织中RRBP1蛋白阳性表达的比较

骨肉瘤组织中RRBP1蛋白阳性表达率为74.73%（68/91），高于正常骨组织[22.22%（9/45）]（χ2=36.714，P<0.001）。见图1。

图1 骨肉瘤组织和正常骨组织中RRBP1蛋白表达（×200）

2.2 不同临床病理参数的骨肉瘤患者之间RRBP1阳性表达的比较

Enneking分期ⅡB～Ⅲ期、有远隔转移的骨肉瘤患者RRBP1蛋白阳性率分别高于Enneking分期ⅡA期、无远隔转移的患者（P<0.05）。不同性别、年龄、肿瘤部位、组织学类型和肿瘤大小的骨肉瘤患者RRBP1蛋白阳性率差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 不同临床病理参数的骨肉瘤患者之间RRBP1阳性表达的比较

2.3 RRBP1表达与骨肉瘤患者预后的关系

91例骨肉瘤患者中，有80例（87.91%）完成随访，随访时间为2～86个月。RRBP1阳性组生存率为26.23%（16/61），生存时间为（39.30±2.53）个月；RRBP1阴性组生存率为68.42%（13/19），生存时间为（57.52±4.78）个月。2个组之间生存率差异有统计学意义（Logrankχ2=8.647，P=0.003）。见图2。

图2 不同RRBP1表达的骨肉瘤患者的Kaplan-Meier生存曲线

2.4 si-RRBP1组、si-NC组、空白对照组细胞和U-2OS细胞RRBP1 mRNA相对表达量比较

si-RRBP1组细胞RRBP1 mRNA相对表达量为0.25±0.07，显著低于si-NC组（1.00±0.10）、空白对照组（1.03±0.09）细胞和U-2OS细胞（1.01±0.08）（P<0.05），si-NC组、空白对照组细胞和U-2OS细胞之间差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。

图3 si-RRBP1组、si-NC组、空白对照组细胞和U-2OS细胞中RRBP1 mRNA相对表达量比较

2.5 si-RRBP1组、si-NC组、空白对照组细胞和U-2OS细胞RRBP1蛋白表达量比较

si-RRBP1组细胞RRBP1蛋白表达量为0.21±0.07，显著低于si-NC组（0.84±0.07）、空白对照组（0.86±0.09）细胞和U-2OS细胞（0.90±0.05）（P<0.05）。见图4。

图4 4组细胞中RRBP1蛋白表达的免疫印迹法图

2.6 si-RRBP1组、si-NC组和空白对照组细胞增殖能力比较

与si-NC组和空白对照组比较，si-RRBP1组培养24、48、72和96 h细胞增殖能力均降低（P<0.05）。见表2、图5。

表2 si-RRBP1组、si-NC组和空白对照组培养不同时间的细胞增殖能力比较（A值）

图5 si-RRBP1组、si-NC组和空白对照组培养不同时间的增殖能力比较

2.7 si-RRBP1组、si-NC组和空白对照组细胞迁移和侵袭能力比较

si-RRBP1组迁移细胞数和侵袭细胞数均低于si-NC组和空白对照组（P<0.05）。见表3、图6、图7。

表3 si-RRBP1组、si-NC组和空白对照组迁移细胞数和侵袭细胞数比较 个

图6 si-RRBP1组、si-NC组和空白对照组细胞侵袭能力（结晶紫染色，×200）

图7 si-RRBP1组、si-NC组和空白对照组细胞迁移能力（结晶紫染色，×200）

3 讨论

骨肉瘤是发病率最高的恶性骨肿瘤，致残率高、致死率高，肿瘤恶性程度高，且呈局部侵袭性生长，易出现远隔转移[10-11]。RRBP1作为一种定位于内质网内，由1 410个氨基酸构成的蛋白，在新生蛋白折叠、运输、分泌中发挥重要作用[12]。正常生理条件下，内质网参与维持蛋白质稳态，但若此过程受干扰，便会出现大量未折叠的蛋白，蓄积在内质网内，导致内质网应激[13-14]，进一步导致未折叠蛋白反应激活[15]，导致肿瘤细胞大量增殖，引发肿瘤[16]。有研究结果显示，RRBP1可通过调节未折叠蛋白反应激活而促进肿瘤细胞存活[17]。本研究结果显示，骨肉瘤组织中RRBP1蛋白阳性表达率高于对照组（P<0.001），说明RRBP1蛋白在骨肉瘤组织中高表达，可能与骨肉瘤发生有关；Enneking分期ⅡB～Ⅲ期和有远隔转移患者的骨肉瘤组织中RRBP1蛋白阳性表达率显著升高（P<0.05），说明RRBP1可能参与骨肉瘤恶性进展和转移过程。

有研究发现，RRBP1过表达与子宫内膜癌、膀胱癌进展和不良预后有关[18-19]，是影响结直肠癌患者预后的危险因素[20]。本研究结果显示，与RRBP1阴性患者比较，RRBP1阳性患者生存率更低，生存时间更短，说明RRBP1蛋白阳性表达与患者生存率和生存时间相关，可能是影响患者预后的危险因素。

本研究结果显示，与si-NC组、空白对照组细胞和U-2OS细胞比较，si-RRBP1组细胞RRBP1 mRNA和蛋白相对表达量均明显降低（P<0.05），提示成功构建低表达的骨肉瘤细胞。有研究结果显示，高糖可通过上调RRBP1表达促进原发性肝癌细胞增殖和转移[21]。本研究结果显示，si-RRBP1组细胞培养12、48、72和96 h时A值均明显低于si-NC组和空白对照组（P<0.05），说明RRBP1低表达可降低骨肉瘤细胞的增殖能力，提示RRBP1可能与骨肉瘤细胞增殖过程有关。有研究证实，RRBP1与膀胱癌T24细胞的迁移和侵袭有关[22]。本研究结果显示，抑制骨肉瘤细胞RRBP1的表达可显著抑制细胞迁移和侵袭的能力，提示RRBP1可能参与了骨肉瘤细胞的迁移、侵袭。

综上所述，骨肉瘤组织RRBP1蛋白高表达，且与患者预后有关。下调RRBP1表达可抑制骨肉瘤细胞的增殖活性，抑制细胞的迁移和侵袭。因此，RRBP1有望成为骨肉瘤靶向治疗的新靶位，但其具体作用机制和可能的作用途径还有待更深入的研究予以明确。