基于高通量测序的甜高粱青贮饲料中微生物群落分析

岳 丽,王 卉,山其米克,再吐尼古丽·库尔班,涂振东

(新疆农业科学院粮食作物研究所,乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】甜高粱是一种能源作物和饲料作物,茎秆富含糖分,单产可达4～10 t/667m2,籽粒可达200～400 kg/667m2,叶蛋白是玉米叶的2倍,再生能力强,生物量是青贮玉米的2～3倍;具有适应性强、耐旱耐热、耐涝耐盐碱和极端温变等特点[1]。在我国西北、东北等地均有大面积种植,被广泛用于动物饲料、生物质能(乙醇、沼气等)和生物基材等领域[2-3]。探究甜高粱青贮饲料中微生物的组成及多样性对提升甜高粱饲料品质具有重要意义。研究基于高通量测序的甜高粱青贮饲料中微生物群落、对青贮饲料的生产与贮藏具有实际意义。【前人研究进展】在干旱地区,高粱每公顷产量高于玉米[4]。甜高粱40%以上的干物质是由易发酵的糖组成[5],是一种优质的反刍动物的饲料来源,主要利用方式有青饲、干草和青贮。目前,多选择青贮的方式对其进行发酵保存。青贮是一种新鲜饲料长期保存的储存技术,具有减少养分损失、增加饲草的利用价值、调整饲草供应时期、提高饲草消化率和动物适口性等优点[6],青贮可以保存甜高粱原料中的营养物质。【本研究切入点】青贮发酵是一种利用微生物活动来实现复杂的物质转化过程,原料中的营养组分和微生物菌群结构都会对其青贮后的饲料发酵品质产生较大的影响[7-9]。目前关于甜高粱青贮饲料青贮菌剂的筛选及营养成分的研究较多[10-13],鲜有关于甜高粱青贮饲料中微生物菌群结构的报道。传统微生物分离培养方法操作繁琐、耗时耗力,且结果不准确。高通量测序近些年被大量用于环境微生物的研究,也可用于青贮微生物的研究[14-16]。需研究基于高通量测序的甜高粱青贮饲料中微生物群落。【拟解决的关键问题】采用高通量测序技术分析未添加与添加青贮菌剂的甜高粱青贮微生物群落结构,从细菌及真菌种类、相对丰度等研究甜高粱青贮饲料微生物的多样性,分析甜高粱青贮饲料的优势菌或致腐菌的种类,为甜高粱青贮专用菌剂的开发利用提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材 料

甜高粱品种:新高粱9号(T601)、新高粱3号(XT- 2),种植在新疆昌吉西部中心试验地。

甜高粱青贮饲料:利用粉碎机将刈割的甜高粱全株粉碎至1～2 cm,加入青贮菌剂和适量的水,搅拌均匀后人工装入青贮罐,一边装填一边压实,装满后盖紧密封盖。

1.2 方 法

1.2.1 试验设计

设置4个不同处理,分别是新高粱9号(A)、新高粱9号+青贮菌剂(B)、新高粱3号(C)、新高粱3号+青贮菌剂(D)。每个处理重复3瓶,密封保存60 d后打开青贮发酵罐,3个重复样品混合均匀取样测定分析。

1.2.2 微生物多样性

使用试剂盒提取甜高粱青贮饲料的总DNA,根据保守区设计得到引物,在引物末端加上测序接头,进行PCR扩增并对其产物进行纯化、定量和均一化形成测序文库,建好的文库先进行文库质检,质检合格的文库用Illumina HiSeq 2500进行测序,由百迈客生物科技有限公司完成测序。细菌主要是基于16S:V3+V4区,真菌主要基于ITS1区测定。

1.3 数据处理

使用 Trimmomatic v0.33软件,对测序得到的 Raw Reads进行过滤;使用cutadapt 1.9.1软件进行引物序列的识别与去除,使用 FLASH v1.2.7软件,通过overlap对每个样品高质量的 Reads 进行拼接,再使用 UCHIME v4.2软件,鉴定并去除嵌合体序列,得到最终有效数据。

2 结果与分析

2.1 青贮饲料样品细菌、真菌测序

研究表明,原始序列范围为 48 228～79 998条,过滤掉低质量序列后细菌质控序列范围为44 844～75 702条,过滤嵌合体后的有效序列范围为 44 062～74 324 条,平均长度为 425～427 个碱基对(bp),GC(%)为 51.68%～52.87%。原始序列范围为 51 480～172 836 条,质控序列范围为 49 593～77 351 条,有效序列范围为48 549～77 351条,平均长度为 178～253 个碱基对,获得 OTU 数量范围为 29～158。不同处理的OTU 数量未添加青贮菌剂的饲料 OTU数量高于添加青贮菌剂的,即A>B、C>D ,未添加青贮菌剂的饲料中微生物群落更丰富。表1

表1 青贮饲料样品细菌、真菌测序统计

2.2 甜高粱青贮饲料中细菌多样性

2.2.1 甜高粱青贮饲料细菌丰度和多样性

研究表明,4 种不同处理共获得 712 个 OTU,其中共有 OTU 数目为200 个,占比为 28.09%。A、B、C和D组分别含有 598、374、505 和 386 个 OUT。其中A>B,C>D,添加青贮菌剂后,OTU 数目随之降低。A、B、C和 D中所特有的 OTU 数目分别为 108、14、6 和7 个。A和 B 2组的635 个 OTU 中,共有 338个 OTU,占比为 53.23%;C和 D 两组的556 个 OTU 中,共有337个 OTU,占比为60.61%;A和C 2个处理的696个 OTU 中,共有408 个 OTU,占比为 58.62%, B和D 2个处理的519个 OTU 中,共有243个 OTU,占比为 46.8%。图1

图1 基于 OTU 水平的甜高粱青贮样品中细菌群落的 Venn 图

研究表明,甜高粱青贮饲料Ace指数在407.90～629.01,Chao 1指数在425.11～634.25,Shannon指数在2.31～5.07。4个甜高粱青贮饲料处理组的测序结果覆盖度都大于 0.99,测定基本覆盖了甜高粱青贮饲料中所有微生物的核心组成。相较于对照组(A、C),添加菌剂组(B、D)的 Chao1 指数和 Ace 指数均有所降低,添加青贮菌剂后甜高粱青贮中细菌的丰度降低;与添加菌剂组(B、D)相比,对照组(A、C)的Simpson指数和Shannon指数均较高,未添加青贮菌剂组,细菌群落多样性较高。表2

表2 样品细菌的 Alpha 多样性指数

2.2.2 细菌群落组成

(1)基于门水平的青贮饲料细菌组成

研究表明,在门水平上,4个处理组样品的优势菌门均为厚壁菌门(Firmicutes),其次是变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroides)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)。放线菌门(Actinobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、梭杆菌(Fusobacteria)在甜高粱青贮饲料中有少量存在。不同处理的样品之间微生物菌群相近,但相对丰度存在明显差异。A、B、C和D中厚壁菌门相对丰度分别为55.45%,78.13%、60.73%、82.78%,其中新高粱9号添加菌剂组比对照组高出40.9%,新高粱3号添加菌剂组比对照组高出36.30%;第2大优势菌群为变形菌门,分别占样品序列的24.11%、17.50%、20.10%、7.69%。青贮菌剂对两个品种的甜高粱青贮饲料中细菌丰度均影响较大。

A、C两组物种丰度大于B、D,即未添加青贮菌剂组甜高粱青贮饲料中物种丰度较大。图2

(2)基于属水平的甜高粱青贮饲料细菌组成

研究表明,在属水平上,4个甜高粱青贮饲料样品中共检测到 11 个细菌属,分别为乳酸杆菌属(Lactobacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)、乳球菌属(Lactococcus)、烟草属(Nicotiana_otophora)、明串珠菌属(Leuconostoc)、绿杆菌属(Ochrobactrum)、棒状杆菌(Corynebacterium)等。相对丰度较高且4组甜高粱青贮饲料中均含有的主要细菌属是乳酸杆菌属、肠杆菌属、乳球菌属、棒状杆菌。A、B、C和D样品中乳酸杆菌属相对丰度分别为39.45%、64.21%、53.85%、81.64%,其中新高粱9号添加菌剂组比对照组高出62.76%,新高粱3号添加菌剂组比对照组高出51.60%。A、B两组中肠杆菌属含量较高,分别为14.27%、12%。添加菌剂组乳酸杆菌均超过60%;相比添加青贮菌剂组,未添加菌剂组A和C中细菌组成种类较多。属水平上,A、C两组物种丰度大于B、D。图3

图 2 基于门水平的细菌组成及物种丰度聚类热图

图 3 基于属水平的细菌组成及物种丰度聚类热图

2.2.3 细菌群落Beta多样性

研究表明, 4 种样品共聚为两大支,新高粱9号对照组(A)与添加青贮菌剂组(B)的细菌属聚为一类,差异较小,新高粱3号对照组(C)与添加青贮菌剂组(D)细菌属聚为另一类。细菌群落Beta多样性与甜高粱品种相关性更大。图4

图4 细菌非度量多维尺度(a)和基于Beta多样性距离的样品层级聚类树(b)

2.3 甜高粱青贮饲料中真菌多样性

2.3.1 甜高粱青贮饲料真菌丰度和多样性

研究表明,4 种不同处理共获得 208 个 OTU,其中共有 OTU 数目为15 个,占比为 7.21%。A、B、C和D分别含有 158、67、154 和 29 个 OUT。A、B、C和 D中所特有的 OTU 数目分别为 30、31、1 和11 个。A和 B 2组的173 个 OTU 中,共有 52个 OTU,占比为30.05%;C和 D 2组的158 个 OTU 中,共有25个 OTU,占比为15.82%;A和C 2个处理的196个 OTU 中,共有116个 OTU,占比为 59.18%, B和D 2个处理的78个 OTU 中,共有18个 OTU,占比为 23.08%。图5

图5 基于 OTU 水平的甜高粱青贮饲料中真菌群落的 Venn 图

4组甜高粱青贮饲料样品的覆盖度均大于 0.99,基本覆盖了甜高粱青贮饲料中所有微生物的核心组成。Ace指数在42～170.43,Chao 1指数在50.04～124.18,Simpson指数在0.06～3.5,Shannon指数在0.01～0.83。甜高粱青贮饲料A的Chao 1指数124.18大于B的Chao 1指数120.95,甜高粱青贮饲料C的Chao 1指数170.74大于D的Chao 1指数50.04,未添加青贮菌剂组A、C的真菌微生物丰度高于B和D。在真菌多样性方面,甜高粱青贮饲料A的Shannon指数0.12小于B的Shannon指数0.21,甜高粱青贮饲料C的Shannon指数0.83大于D的Shannon指数0.01。表3

表3 甜高粱青贮饲料中真菌的 Alpha 多样性

2.3.2 真菌群落组成

(1)基于门水平的青贮饲料真菌组成

研究表明,各处理组的优势菌门均为子囊菌门,在青贮饲料中占菌群的 85%以上。除此之外,担子菌门有少量存在。B组子囊菌门的相对丰度相较于A 组 (93.89%)增加了5.5%,D组子囊菌门的相对丰度相较于C 组 (88.24%)增加了13.29%。A、C 2组甜高粱青贮饲料中未分类真菌相对丰度分别为5.69%、8.36%。添加青贮菌剂可提高甜高粱青贮饲料中子囊菌门所占比例,降低杂菌所占比例,减少其他真菌的产生。图6

图6 基于门水平的甜高粱青贮饲料真菌组成及物种丰度聚类热图

(2)基于属水平的青贮饲料真菌组成

研究表明,4 个处理组的优势菌属不同。其中 A、D 组为念珠菌,相对丰度分别为 88.3%、99.4%;B组为镰刀菌相对丰度为 88.4%;C组优势菌属为柳条菌属,相对丰度为 74.75%。图7

图7 基于属水平的甜高粱青贮饲料真菌组成及物种丰度聚类热图

3 讨 论

3.1Alpha 多样性主要通过ACE 指数、 Chao1 指数、Shannon 指数、Simpson 指数4个指标来分析[17],其中 Chao1 指数和 ACE 指数用来估算群落丰富度,Shannon 指数和 Simpson 指数用来估算群落多样性,Shannon 指数越大、Simpson指数越低,表明样品微生物多样性越高[18]。根据距离矩阵获得相应距离下的甜高粱青贮饲料样品层次聚类(UPGMA)树、非度量多维尺度(NMDS)分析比较不同甜高粱品种及处理在物种多样性方面(群落组成及结构)存在的差异大小[19-20]。甜高粱是我国干旱、半干旱和高盐碱地区畜牧业的优质饲草来源[21]。甜高粱可溶性碳水化合物含量较高, 缓冲能低, 容易调制品质优质的青贮饲料[22]。微生物结构与多样性影响着青贮发酵饲料品质与营养成分[23]。研究发现,青贮菌剂能明显提高青贮饲料的发酵品质,有助于原料中营养成分的保留[24]。

3.2甜高粱青贮饲料中优势菌属为乳酸杆菌属、肠杆菌属、乳球菌属,与苜蓿青贮发酵的优势菌属有相同菌属也有差异[25],可能是由于不同青贮原料青贮微生物多样性本身存在差异。探究不同添加剂对构树青贮饲料发酵品质及微生物多样性的影响,结果说明添加剂的不同影响微生物群落的结构,添加剂组厚壁菌门的相对丰度较对照组是增加的趋势,变形菌门的相对丰度随着厚壁菌门相对丰度的升高而相应降低[26]。与研究的青贮菌剂可降低细菌及真菌的相对丰度结果一致。杨宝钰[27]研究了瘤胃液处理甜高粱秸秆对其微生物多样性的影响,结果表明在门水平上,各处理组优势菌群相对丰度最高为厚壁菌门;在属水平上,各处理组优势菌群相对丰度最高为乳杆菌属,不同品种的甜高粱青贮饲料中优势菌属均为乳杆菌属。

4 结 论

4.1甜高粱青贮饲料中细菌群落主要有厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroides)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria);真菌群落优势菌门为子囊菌门,在青贮饲料中占菌群的 85%以上。

4.2不同处理的甜高粱青贮饲料之间微生物菌群组成相近,但相对丰度存在明显差异。青贮菌剂对甜高粱青贮饲料中微生物多样性影响较大,添加青贮菌剂,可降低细菌及真菌的相对丰度。