利用GC-IMS分析3个核桃品种叶片挥发性物质指纹差异

王如月,罗莎莎,王 茹,虎海防,孙雅丽

(1.新疆农业大学,乌鲁木齐 830052;2.新疆佳木果树学长期科研基地,新疆温宿 843100;3.新疆林业科学院,乌鲁木齐 830062)

0 引 言

【研究意义】核桃(JuglansregiaL.)为胡桃科(Juglandaceae)核桃属(Juglans),是世界四大干果之一[1]。核桃在我国分布广泛,种质资源丰富[2],核桃有健脾补血等功效[3],核仁富含蛋白质、脂肪、膳食纤维、微量元素等物质,具有较高的营养价值[4]。核桃除核仁具营养价值之外,其枝、叶、果均具有较高的利用价值。【前人研究进展】核桃叶片中存在大量黄酮类化合物、萜类化合物及胡萝卜素[5],黄酮具有抗氧化、调节细胞增殖等作用[6],萜类化合物是核桃叶片中的挥发油组分中的主要化合物,是挥发性成分的活性部分[7]。目前大多研究集中在核桃品质、药用、加工及育种等方面,张锐等[8]通过研究水肥耦合对核桃品质的影响,表明适当水肥耦合处理可以提高核桃品质;王新平等[9]研究认为核桃枝叶中含有大量香精油、鞣质、VC、多酚复合物等物质,其内含物质有一定的药用价值。但对核桃叶片相关研究较少,张博等[10]以水浸提法提取两种核桃叶片中内含物胡桃醌;结果表明其内含物质可抑制萝卜、小麦等植物种子的萌发及幼苗生长,且薄壳山核桃中胡桃醌含量明显高于山核桃。张捷莉等[11]利用毛细管气相色谱-质谱-计算机联用法(GC-MS)法从核桃叶片挥发油中分离鉴定了32种化学成分,有一定的药用及营养价值;王淑萍[12]采用气相色谱-质谱联用法(GC-MS)从核桃楸叶片挥发油中鉴定了51种化合物及7大类化合物,其中已知药用成分有27种,占总成分的51.19%。陈友吾等[13]对浙江栽培的美国山核桃、山核桃叶片中的挥发性物质进行采集,利用鉴定出50种化合物质。核桃叶叶片的挥发物质有增强细胞活性作用[14];以及对细菌有着明显抑制作用[15];且随着叶片时期的不同其挥发性物质成分及种类也有所差异[16],以及对细菌有着明显抑制作用[15];对不同核桃品种叶片的挥发性成分差异进行研究,对核桃叶片资源多功能开发有着现实意义。【本研究切入点】对核桃叶片中挥发性化合物的检测及鉴定最常用的方法是气相色谱-质谱-计算机联用法[17],但气相色谱-质谱-计算机联用(GC-MS)法因环境因子及品种的不同对其挥发性物质的检测及鉴定较为困难且差异较大,而气相色谱—离子迁移谱(Gas chromatographyion mobility srectorscopy,GC-IMS)是一种高灵敏度、快速响应、二维分离核痕量分析等检测特点的气象分离检测技术,既弥补了GC-MS对痕量小分子检测灵敏度与质谱信息量不足问题,又可以精确地检测到极其微量成分,且样品不需任何前处理,目前已用于食品成分[18-20]、产地[21]及品种[22]及药材品种产地[23]、成分[24]挥发成分检测等不同领域中,但对不同核桃品种叶片挥发物质检测鲜有报道。需更加快速、全面系统的鉴定不同品种样品挥发性成分。【拟解决的关键问题】利用GC-IMS对3个核桃品种叶片释放的挥发性有机图谱信息分析其组成成分及其含量差异,研究不同核桃品种叶片挥发性物质的释放规律及其含量差异,为核桃叶片挥发性有机物的提取、气味资源利用及区分不同核桃品种提供途径。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 核桃品种

试验样品采集于新疆佳木果树学国家长期科研基地,收集3个核桃品种叶片为材料,试材品种为山核桃、温185和美国红核桃。采样树龄为9 a,株行距为4 m×6 m,生长健壮、无病虫害。于2021年采摘相同部位且采摘的叶片完整,每个树种选3棵样树,树形为开心形,从核桃树的东、西、南、北 4个方位收集,每个采样点随机取叶片数20片,每品种采样共80片,样品采摘大小相似。收集的叶片进行筛选,去除灰尘及其他杂质。按样品号分别标记,称重,液氮处理,-80℃低温冰箱保存备用。

1.1.2 仪器与设备

CTC Combi-PAL自动顶空进样器丹麦Densensor公司;Flavour Spec®气相色谱-离子迁移谱联用仪:配有Laboratory Analytical Vievwer(LAV)分析软件及GC-IMS Library Search定性分析德国G.A.S公司。

1.2 方 法

1.2.1 分析条件

试验所用的Flavour Spec 1H1-00053型GC-IMS的可控参数包括:IMS温度控制、色谱柱选择、进样器温度、漂流气和载气流速、正、负两级离子化模块切换;配备的顶空进样装置可调的参数有孵化温度、孵化时间和进样。表1

表1 分析条件[26-27]

1.2.2 GC-IMS技术检测

每个品种取20片核桃叶,取5.0 g样品,放入20.0 mL顶空进样瓶中45°C孵化15.0 min,经顶空进样用FlavourSpec®风味分析仪进行测试,每个品种做3个平行样品,给出样品中挥发性有机物的差异谱图;软件内置的NIST数据库和IMS数据库可对物质进行定性分析。

1.3 数据处理

使用仪器配套的分析软件VOCal,用于查看分析谱图和数据的定性定量,应用软件内置的NIST数据库和IMS数据库可对物质进行定性分析。Reporter插件直接对比样品之间的谱图差异(三维谱图、二维俯视图和差异谱图);运用Gallery Plot插件指纹图谱对比,直观且定量的比较不同样品之间的挥发性有机物差异;运用Dynamic PCA插件进行动态主成分分析,用于将样品聚类分析,以及快速确定未知样品挥发物质的种类。

采用软件SPSS V20版(IBM SPSS Statistics 20)对数据进行显著性差异分析。处理3个平行数据并将其最终表示为平均值±标准偏差。

采用Tbtools软件对数据进行聚类热图分析。

2 结果与分析

2.1 3个核桃品种叶片特征气味定性

研究表明,3个核桃品种叶片通过GC-IMS共检测出59种挥发性成分,其中酯类13种、醛类11种、醇类15种、酮类4种、萜烯类13种、酸类1种、其他类3种,且检测出的59中化合物包含7对单体与二聚体。在检测的物质中其中醇类和酯类共有28种,醇类和酯类是核桃叶片主要的挥发成分。相同挥发性物质在3个核桃品种叶片中存在显著差异。在核桃叶片的挥发性物质及各挥发性物质的峰强度信息,峰强度越大,表示该物质的相对浓度越高;山核桃样品中的挥发性物质成分3-甲基丁醛、丁二酮、1,8-桉叶素、α-松油烯、水芹烯等物质的含量较高,且3-甲基丁醛、丁二酮、1,8-桉叶素、α-松油烯、水芹烯分别在山核桃、温185、美国红核桃中的物质浓度均存在差异,美国红核桃中丁二酮浓度含量明显高于山核桃,可通过样品中酮类物质浓度和萜烯类物质浓度的高低来区分山核桃与美国红核桃。3个核桃品种叶片中挥发性物质在图中的峰数和峰位大致相同,温185叶片中挥发性物质成分以(E,E)-2,4-辛二烯醛、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、1-己醇、E-2-戊烯醛、2-乙基呋喃、2,5-二甲基呋喃、1-丙醇、α-水芹烯、水杨酸甲酯等物质为主;且随着运行时间规律性升高些许挥发性物质浓度降低;美国红核桃叶片中挥发性物质中芳樟醇、β-罗勒烯、柠檬烯、月桂烯、β-蒎烯、莰烯、α-蒎烯、(E,Z)-2,6-壬二烯醛、庚醛、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、3-甲基戊醇、异戊醇、2,3-丁二酮、丙酮、2-丁酮、乙缩醛等物质的含量较高;且与山核桃和温185均有明显差异,浓度含量均高于其他两个品种。图1、表2

注:A、B、C分别代表山核桃、温185和美国红核桃,下同

表2 不同品种核桃叶片挥发性成分及其差异

2.2 3个核桃品种叶片挥发性物质特征

研究表明,3个核桃品种叶片的峰数和峰位大致相同,其中样品A为山核桃,样品B为温185、样品C为美国红核桃。温185中挥发性物质成分以(E,E)-2,4-辛二烯醛、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、1-己醇、E-2-戊烯醛、2-乙基呋喃、2,5-二甲基呋喃、1-丙醇、α-水芹烯、水杨酸甲酯等物质为主;且随着运行时间规律性升高温185叶片中些许挥发性物质浓度降低;美国红核桃叶片中挥发性物质中芳樟醇、β-罗勒烯、柠檬烯、月桂烯、β-蒎烯、莰烯、α-蒎烯、(E,Z)-2,6-壬二烯醛、庚醛、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、3-甲基戊醇、异戊醇、2,3-丁二酮、丙酮、2-丁酮、乙缩醛等物质的含量较高;且与山核桃和温185均有明显差异,浓度含量均高于其他两个样品。图1

续表2 不同品种核桃叶片挥发性成分及其差异

2.3 3个核桃品种特征气味离子迁移色谱(GC-IMS)指纹图谱

研究表明,峰整体相对3个不同品种核桃较为相似,温185(样品B)较山核桃(样品A)和美国红核桃(样品C)中的挥发性化合物较为丰富。

二维谱图与三维谱图相比,横坐标1.0红色竖线处为RIP峰,纵坐标代表气相色谱保留时间(s),横坐标代表离子迁移时间(经归一化处理),RIP峰两侧的每一个点代表一种挥发性物质,点的颜色为白色或近似蓝色代表化合物物质浓度较低,点的颜色为红色代表物质浓度较高且丰富。山核桃、温185和美国红核桃特征挥发组分可以通过GC-IMS技术很好的分离。温185叶片中挥发性物质含量要多于山核桃和美国红核桃,且山核桃和美国红核桃挥发性物质保留时间在500S以内。图2,图3

图2 不同核桃叶片挥发性有机物的GC-IMS三维图谱

图3 核桃叶片气象离子迁移谱

选取美国红核桃(样品C)作为参比,其他样品的谱图扣减参比。其中样品A为山核桃,样品B为温185,样品C为美国红核桃。如果二者挥发性有机物一致,则扣减后的背景为白色,而红色代表该物质的浓度高于参比,蓝色代表该物质的浓度低于参比。将美国红核桃扣除背景时,山核桃和温185中有较多红色斑点,其中温185较之山核桃挥发性物质丰富,温185中挥发性物质较多且丰富,山核桃与美国红核桃中的挥发性物质有明显差异,山核桃与美国红核桃的挥发性物质浓度对比差异较为明显,美国红核桃中化合物含量明显高于山核桃(样品A),3个不同核桃品种挥发性物质特征图谱存在差异。图4

图4 三种核桃叶片GC-IMS差图谱

2.4 3种核桃挥发性物质指纹图谱

研究表明,每种样品完整挥发性有机物信息以及样品之间挥发性有机物的差异。图中未检测出化合物定性的用数字替代,其中以检测出已知定性挥发性物质59种, 未知化合物13种, 排列时将变化规律相似地排列在一起,并根据不同样品将其编号为A、B、C 3个位置。

红色框A区中为山核桃(样品A)挥发性物质,其中桉叶油醇、异丁醇、β蒎烯物质浓度较为丰富,且含量明显高于样品B和样品C,图中黄色框代表温185(样品B)所含挥发性物质浓度差异,黄色框中所含物质在温185中较为明显,且与其他两个样品有明显差异,B区物质中水杨酸甲酯、2,5-二甲基呋喃、2-乙基呋喃、反式-2-戊烯醇、正乙醇、2,4-己二烯醛等化合物浓度明显高于其他两个样品,其中水杨酸甲酯中的浓度含量虽低但明显比样品A和样品C丰富,且差异较大;2,5-二甲基呋喃、2-乙基呋喃、反式-2-戊烯醇中物质浓度与山核桃中所含其物质浓度含量差异较小,但与美国红核桃有着明显差异,C区是绿色方框,其所代表样品为美国红核桃(样品C),在美国红核桃中,其中乙缩醛二乙醇、丁酮、丙酮、丁二酮、异戊醇、异丁醇二聚体、2-异丁酸乙酯、庚醛等物质在绿色框中颜色相对其他两个品种颜色较深,这些物质中的化合物浓度含量较为丰富且明显高于其他两个样品。在3个核桃品种叶片所含挥发性物质如丁二酮、3-甲基丁醛、β蒎烯等物质在指纹图谱中的颜色逐渐变浅或消失,2-异丁酸乙酯、异戊醇、异丁醇、桉叶油醇、异丁醇等不同醇类物质含量逐渐增加,且这些物质在美国红核桃中含量较高,温185和山核桃次之。图5

图5 3种核桃叶片中挥发性有机物的Gallery Plot

2.5 3个核桃品种叶片挥发性物质成分定量

研究表明,酯类挥发性物质在温185中含量最高,相对含量达11.63%,山核桃中醇类物质含量较小,与温185差异较大,仅达3.87%,山核桃在醛类和醇类中相对含量较高,为24.69%和36.14%,温185在醛类和醇类中的相对含量为20.44%、26.08%,与山核桃相对含量相比次之,美国红核桃中醇类和醛类中的含量与山核桃相比差异较大,相对含量为13.5%、22.12%。在萜烯类中美国红核桃相对含量较高为42.03%,山核桃为20.06%,与温185相比相对含量有明显差异,为2.22%;萜烯类物质可作为区分3个核桃品种叶片挥发性物质成分定量标准之一。山核桃、温185和美国红核桃在酮类中含量相对其他含量较低,为5.47%、5.13%和7.95%。而其他类中挥发性物质含量在山核桃、温185和美国红核桃中含量与酮类差异较小,为9.96%、8.01%和3.7%;在其他类中山核桃相对含量与美国红核桃有较大差异。表3,图6

续表3 不同核桃叶片挥发性有机物相对含量

图6 不同核桃叶片挥发性物质相对含量差异比较

表3 不同核桃叶片挥发性有机物相对含量

在酯类挥发性物质中,山核桃、温185和美国红核桃在酯类气味物质中乙酸乙酯相对含量分别达到峰值,为1.28%、3.72%和6.8%;在醛类气味物质中2-己烯醛在16.46%、12.92%和6.93%时挥发性物质相对含量达到峰值,在醇类物质中山核桃和温185在桉叶油醇中含量较高,与其他醇类物质相比有较大差异且达到峰值,相对含量为14.52%和7.67%。美国红核桃中乙醇含量较高并达到峰值,相对含量为8.85%。酮类物质中丙酮含量分别在山核桃、温185、美国红核桃中的相对含量达到最高峰,为3.59%、3.63%和5.53%;美国红核桃在萜烯类物质中其相对含量高于山核桃和温185,并在β-蒎烯二聚体和α- 蒎烯二聚体中达到最大值,相对含量分别为8.84%和6.98%,温185次之,相对含量为6.48%、4.58%。山核桃在β-蒎烯的风味物质相对含量较高,为7.23%。山核桃、温185和美国红核桃在其他类中2,5-二甲基呋喃的风味物质含量较高,相对含量分别为7.67%、5.86%和3.25%。图7

图7 不同种类挥发性物质在不同核桃叶片中相对含量

2.6 3个核桃品种挥发性气味物质热图

研究表明,峰强度越大物质含量丰富,浓度越高。样品中挥发性物质含量越高颜色越红,蓝色代表该样品中物质含量较低,不同样品相同物质含量之间差异程度。3种不同核桃叶片样品可聚为3类,且甲基庚烯酮、1-戊醇、正已醇和正已酸乙酯在山核桃中含量均较低,在温185中挥发性物质含量较高;美国红核桃中乙缩醛二乙醇、2-异丁酸乙酯、乙酸异丁酯、异戊醇等在热图中颜色偏红,在美国红核桃中此类风味物质较与温185和山核桃相比较为丰富;2,4-已二烯醛、醋酸正戊酯、乙酸异丁酯、反式-2-戊烯醇、异丁醇二聚体、1-戊醇、甲基庚烯酮等风味物质含量在温185中含量较高,且与山核桃和美国红核桃有明显差异,相同挥发性物质在不同品种中的含量有所差异。图8

图8 不同核桃叶片挥发性成分聚类热图

2.7 3个核桃品种挥发性风味物质主成分

研究表明,黑色点为山核桃样品,红色点为温185样品、绿色为美国红核桃叶片样品,其中PC1的贡献率为53.7%,PC2的贡献率为34.5%,二者累计贡献率达88.2%,相同种类样品聚在一起,试验重复性较好,而不同种类的核桃叶片样品间相隔较远,且样品之间没有重叠,采用GC-IMS技术结合主成分分析法能够较好地从挥发性物质组成上判别和区分不同品种核桃叶片。温185和美国红核桃二者距离较近,2个不同品种核桃叶片中的风味物质较为相似,山核桃较之美国红核桃及温185距离较远。图9

图9 不同核桃叶片PCA分析

3 讨 论

3.1通过GC-MS对核桃叶片挥发性物质检测出色谱峰30个,鉴定出已知化合物20种,其余化学成分因质谱信息不足未能确认其结构[16]。陈友吾等[13]通过GC-MS对两种不同核桃叶片中挥发性物质检测,共检出挥发性化合物质35种。其中挥发性物质种类少,含量低且不同品种间挥发性物质差异较小。目前,风味化学物质的检测设备多、样本量大且时间长,另外,挥发性物质的释放以及对气味的感知随着外界因素以及内在因素的延长而改变,且风味物质的分析、检测以及鉴定需要快速和无破坏性分析技术。与目前流行GC-MS相比,GC-IMS具有检测速度快、操作方便、环保等操作特点[29,30],也可对不同样品挥发性成分差异对此进行明确分类[31],且样品的原始状态能够很原始的展示出来,更能提高分辨率。酮类包括丁二酮、2-丙酮等,且酮类的挥发性物质主要来自脂肪氧化和美拉德反应[28]。目前研究者利用GC-MS检测核桃叶片中挥发性物质仅检测出醇类、酯类等化合物,一些含量较少如酸类及萜烯类等物质较难检测出来。GC-IMS可检测到更多化合物,赵玲等[32]通过对银鲑不同部位肌肉营养物质进行检测,结果表明除检测出较为常见的几种挥发性物质,还利用GC-IMS检测出硫化合物等物质,共检测出33种挥发性成分,且在不同部位的挥发性物质差异明显,为特征挥发性物质描述提供完整画面,此外,还可提供清晰的色谱图和质谱以及质谱附加信息,以根据不同挥发性物质差异区分不同核桃品种叶片差异。

3.2在GC-IMS中检测出的数据对此进行定性及定量分析,数据参照标准为保留时间、漂移时间及不同品种峰体积;经GC-IMS分析后,在山核桃、温185和美国红核桃不同品种核桃叶片中共检测到59种化合物,且已知其化合物化学结构,徐效圣等[33]运用GC-MS对新丰挥发性物质进行分析,共检测出17种风味物质,包括醇类、醛类、酯类等化合物;胡玉霞等[34]运用GC-IMS对核桃的风味物质进行定性分析,共检测出醛类、醇类、酯类等53种化合物,醛类、醇类、酯类等物质是核桃中主要的化学成分。且根据分析GC-IMS相对GC-MS来说操作更为简单,且对不同品种中风味物质种类及含量的检测更为细致,试验利用GC-IMS对3个核桃品种叶片中风味物质进行检测并分析,其中检测出酯类13种、醛类11种、醇类15种、萜烯类13种、其他类3种、酮类5种及酸类物质1种,与上述研究结果一致,但酸类物质及酮类物质相对含量较少,未鉴定出挥发性物质中应该含有少量酸类物质及酮类物质。

3.3王茹等[25]利用GC-IMS法对8个不同核桃叶片挥发性物质分析发现,不同样品有明显差异,温185和美国红核桃属胡桃属相对于山核桃来说差异较小,通过不同化合物在其中相对含量的高低可明显区别开来。张文君等[35]对不同产地翠冠梨果的GC-IMS挥发性物质指纹图谱差异分析,经研究并鉴定得挥发性物质有酯类、醇类、醛类及酮类等物质43种,且香气因翠冠梨果的产地不同而有明显差异。赵明等[36]利用GC-MS对不同香蕉品种果实香气品质进行分析,研究表明不同品种间果实香气存在差异且含量有所不同;孟祥春等[37]利用GC-IMS对5个不同品种荔枝挥发性物质差异性进行比较分析,结果表明不同品种荔枝挥发性成分有明显且独立的特征峰区域,可通过挥发性物质较好区分不同荔枝品种。基于此,由研究结果得知,不同品种核桃叶片中挥发性物质成分有较大差异,且核桃叶片中挥发性物质因亲缘关系远近而有所差异。核桃叶片因气候环境因子、自身枝条生长条件不同生长发育也有所差异,因此研究采用固定样地、树龄条件、枝条对此进行采样,通过GC-IMS技术方法对3个不同核桃叶片挥发性物质进行分析,可区分不同核桃品种,为下一步区分不同核桃品种提供科学依据。

4 结 论

共检测出59种化合物质,包括酯类12种、醛类11种、醇类15种、酮类4种、酸类1种、萜烯类13种及其他类3种,其中山核桃在醇类(36.14%)和醛类(24.69%)中含量较高,山核桃在醇类物质中呈现上升后快速下降后缓慢回升趋势,且在14.52%时达到峰值,在醛类挥发性物质中先趋于平稳状态后快速上升、下降有缓慢回升,峰值为12.92%;温185在酯类、醛类、醇类中含量较高,相对浓度含量为11.63%、20.44%和26.08%,其中在酯类物质、醛类及醇类中分别在3.72%、12.92%和7.67%达到峰值,且与山核桃和美国红核桃有较大差异;美国红核桃在醇类和萜烯类中含量比山核桃和温185较高,为22.12%和42.03%,且在相对含量为5.59%和6.48%时达到最高峰。核桃叶片中醇类、酯类、醛类中挥发性物质含量较高,萜烯类中美国红核桃含量较高,并与山核桃有较大差异。