喹诺酮信号分子对lasR 缺陷型铜绿假单胞菌绿脓菌素活性的影响

王延茹，段金菊

（1.山西医科大学汾阳学院 基础医学部药理教研室，山西汾阳 032200；2.山西医科大学第二医院 药学部，山西太原 030001）

铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa，PA）广泛存在于自然界，是临床分离率高且耐药性强的条件致病菌[1-3]。绿脓菌素是PA 分泌的一种蓝绿色吩嗪类次级代谢产物，不仅能自由地穿透生物膜、干扰正常离子转运、打断细胞呼吸链、过量产生氧自由基导致细胞死亡，还参与细菌外排泵的激活[4-5]，因此，绿脓菌素在PA 定植、感染以及耐药的发生发展过程中发挥着重要的作用。绿脓菌素受多种调控信号网络介导[6]，研究较为成熟的是群体感应（Quorum Sensing，QS）系统，该系统参与绿脓菌素在内的多种毒力因子的调控[7-10]。喹诺酮信号分子（Pseudomonas Quinolone Signal，PQS）是QS 系统中至关重要的信号分子[11-12]，由于在慢性感染人群（如囊性纤维化患者）的临床标本中经常发现lasR缺陷突变菌[2,13]，该菌不产生或产生极少量的内源性PQS[2,7]，却能增强绿脓菌素的表达[13]。本研究选取临床分离lasR 缺陷菌株与正常菌株为研究对象，对比探究PQS 不同诱导方案对两种菌株绿脓菌素活性的影响，旨在进一步了解PQS对铜绿假单胞菌致病性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

收集2021 年3 月至2022 年10 月山西医科大学第二医院经全自动鉴定仪VITEK-2 鉴定的铜绿假单胞菌作为研究对象。正常组纳入标准：由临床血培养及胸水腹水等无菌体液分离得到；非重复菌株；QS基因正常。排除标准：经PCR 扩增及DNA 测序检测QS 基因lasR、rhlR、lasI、rhlI以及pqsR单一或多种基因缺失[14]。只有lasR基因缺失菌株为缺陷组。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC 15692（PAO1），为南开大学生命科学学院分子微生物学与微生物工程实验室惠赠。收集到的正常菌株和lasR缺陷菌株作为本研究的原始菌株。

1.1.2 试剂与仪器

PQS，HPLC 级，批号BCBR3314V，美国Sigma-Aldrich 公司；0.9%氯化钠注射液，医用级，石家庄四药有限公司；氯仿，分析纯，北京化工厂有限责任公司；盐酸，分析纯，深圳市精成科技有限公司；血培养皿，济南百博生物技术股份有限公司；绿脓菌素测定用培养基，批号210322，北京陆桥技术有限责任公司；一次性使用培养皿，江苏康健医疗用品有限公司；LB 液体培养基，北京陆桥技术有限责任公司。

SpectraMax 190 全波长酶标仪，上海美谷分子仪器有限公司；BY-R20 型低温高速离心机，北京白洋医疗器械有限公司；GNP-9270BS-Ⅲ隔水式恒温培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；LMQ.C 型立式高压灭菌锅，山东新华医疗器械股份有限公司；21255 麦氏比浊仪，生物梅里埃公司；Costar-3599 型96 孔板，美国康宁公司。

1.2 方法

1.2.1 PQS 诱导方案

（1）复苏菌株：将保存于-70 ℃的原始菌株接种于血培养皿，37 ℃恒温过夜培养；（2）配制含PQS培养基：分别配制10 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L的含PQS 固体培养基；（3）传代培养：将纯化的铜绿假单胞菌用无菌0.9%NaCl 调成3.0 麦氏单位，取菌液20 μL 接种于上述含药培养基中，恒温培养24 h后作为诱导一天的菌株；将诱导一天菌株用无菌0.9%NaCl 调成3.0 麦氏单位，取菌液20 μL 接种于上述含PQS 新培养基中继续恒温培养24 h 作为诱导第二天的菌株；以此类推，分别诱导至第五天，将完成诱导的菌株分别在-70 ℃保存于液体培养基中。

1.2.2 绿脓菌素活性的测定

（1）绿脓菌素测定用培养基的配制：按每100 mL蒸馏水中含4.64 g 绿脓菌素测定用培养基、1 g 甘油的比例进行配制，充分摇匀，以121 ℃高压灭菌20 min，室温冷却至50 ～60 ℃，倾倒于一次性培养皿中（大约20 mL），静置至完全凝固，于4 ℃冰箱保存，备用（七天内用完）[15]。

（2）OD600的测定：复苏菌株后，挑取单个菌落于经高压灭菌的LB 培养液中，使用比浊仪调节菌悬液的麦氏单位为2.5，吸取200 μL 于96 孔板中，用酶标仪测OD600（LB 培养液做空白对照）。

（3）菌悬液的培养：取上述2 mL LB 菌悬液于24 孔板中，置于振荡器上振荡培养24 h（130 r/min，37 ℃）。

（4）OD520的测定：将24 孔板中的菌悬液吸取到灭菌EP 管中，经高速离心机12 000 r/min 离心5 min，取上清于灭菌试管中，加入3 mL 氯仿，吸打混匀，轻轻摇动萃取20 min；将下层溶液移入干净的试管，加入1 mL 0.2 mol/L 的盐酸，吸打混匀，轻轻摇动萃取20 min；取上层盐酸溶液于96 孔板，酶标仪测OD520（空白对照为LB 培养液经双相萃取后的盐酸溶液）。

（5）活性计算。绿脓菌素活性=OD520/OD600。

1.3 观察指标与评价标准

观察正常组和缺陷组经不同浓度PQS（10 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）和不同时间（1 d、2 d、3 d、4 d 和5 d）诱导绿脓菌素活性的变化，以未进行PQS诱导的原始菌株的OD520/OD600值作为基值，高于或低于原始菌株的基值被认为促进或抑制绿脓菌素的活性。诱导前正常组和缺陷组绿脓菌素活性的大小与质控菌株进行比较。实验独立重复三次。

1.4 统计学方法

用SPSS 22.0 软件进行统计分析，诱导前正常组和缺陷组绿脓菌素活性的比较采用秩和检验，P＜0.05 认为差异有统计学意义；原始菌株经不同浓度PQS 和不同时间诱导对绿脓菌素活性的影响采用重复测量方差分析进行统计分析，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 菌株的收集

从临床分离得到符合条件的原始菌株共10 株，正常组和缺陷组各5 株，分别经不同浓度PQS 和不同时间诱导最终共保存160 株铜绿假单胞菌。

2.2 PQS 诱导前正常组和缺陷组绿脓菌素活性的比较

PQS 诱导前正常组与缺陷组绿脓菌素活性比较的结果见表1，P=0.008，表明诱导前两组的绿脓菌素活性差异有统计学意义（P＜0.05），缺陷组的绿脓菌素活性低于正常组，缺陷组的绿脓菌素活性低于PAO1。

表1 诱导前两组绿脓菌素活性的比较

2.3 PA 经PQS 不同诱导方案后正常组和缺陷组绿脓菌素活性的比较

不同诱导方案下，正常组和缺陷组绿脓菌素活性结果如表2 所示，相关分析见2.3.1 和2.3.2。

表2 正常组和缺陷组经PQS 不同诱导方案绿脓菌素活性的组内比较

2.3.1 正常组与缺陷组组内比较

正常组与缺陷组经PQS 不同诱导方案绿脓菌素活性的组内比较见表3。结果表明，不考虑诱导浓度间的差异（即不同诱导时间下的活性均值），正常组在不同时间的绿脓菌素活性差异有统计学意义（P＜0.05），缺陷组活性差异没有统计学意义（P＞0.05）；不考虑诱导时间之间的差异（即不同诱导浓度下的活性均值），正常组在不同诱导浓度下的绿脓菌素活性差异有统计学意义（P＜0.05），缺陷组活性差异没有统计学意义（P＞0.05）。

表3 正常组和缺陷组经PQS 不同诱导方案绿脓菌素活性的组内比较

具体地，正常组随诱导时间的延长绿脓菌素的活性不同程度地增加（除了诱导3 d 时活性较1 d 和2 d稍有降低），其中10 μmol/L 和80 μmol/L 的诱导浓度下差异显著（P＜0.05），40 μmol/L 时差异不显著（P＞0.05）；缺陷组在同一诱导浓度下随诱导时间的延长绿脓菌素的活性变化不明显（P＞0.05）。除了正常组在诱导3 d 时随诱导浓度的增加绿脓菌素的活性变化有统计学差异（P＜0.05），两组在同一诱导时间下随诱导浓度的增加绿脓菌素的活性变化均不明显（P＞0.05）。正常组和缺陷组的诱导时间与诱导浓度之间均无交互作用（正常组F=0.612，P=0.643；缺陷组F=0.919，P=0.446），表明两组分别在不同PQS 诱导浓度下，绿脓菌素活性随诱导时间的延长变化的趋势相近。

2.3.2 正常组与缺陷组组间比较

正常组与缺陷组经不同诱导方案绿脓菌素活性的组间比较见表4，两组菌株在诱导1 d、2 d、3 d、4 d 和5 d 时绿脓菌素活性差异均有统计学意义（P＜0.05），缺陷组的绿脓菌素活性均显著低于正常组。两组菌株在诱导浓度10 μmol/L、40 μmol/L 和80 μmol/L 时，绿脓菌素活性差异均有统计学意义（P＜0.05），缺陷组的绿脓菌素活性均低于正常组。

表4 正常组与缺陷组经不同诱导方案绿脓菌素活性的组间比较

3 结论与讨论

铜绿假单胞菌导致的严重感染与其自身产生的毒力因子密切相关，毒力因子活性越强，引起的感染症状越严重。PA 的毒力因子主要受三个QS 系统，即以高丝氨酸内酯为信号分子的Las 系统、Rhl 系统和以喹诺酮类为信号分子的PQS 系统的调控。三个系统相互制约，构成一个错综复杂而又井然有序的调控网络。Las 系统位于调控网络的上游，由转录激活因子lasR 和信号合成酶lasI 组成，正向调控Rhl 和PQS系统；PQS 系统位于中间层级，起连接作用，可正调节rhlI、lasI基因的表达，又受Rhl 系统的负调节[7-9,16]。绿脓菌素的生成主要受Rhl 和PQS 系统的调控，PQS可直接上调phzA-G 操纵子的表达，促进吩嗪类的合成[17-18]，如DIGGLE 等[19]发现外源性PQS 能促进绿脓菌素的提前表达。本课题组前期研究[12]已表明，与诱导前相比，外源性PQS 不同诱导方案对铜绿假单胞菌绿脓菌素的活性有促进作用，但是只研究了基因正常的铜绿假单胞菌，可能忽略了内源性PQS 对绿脓菌素活性的影响。

研究表明，囊性纤维化患者临床标本中经常出现的lasR缺陷突变株不产生或产生极少量的内源性PQS，部分突变株能生成绿脓菌素，甚至有研究显示Las 系统对绿脓菌素的生成呈负向调控，PAO1 的lasR缺陷突变株比野生型菌株生成绿脓菌素的能力增强[2,10,13]。然而，本研究发现，诱导前lasR缺陷菌株的绿脓菌素活性低于正常菌株和PAO1，可能与菌株的来源有关，菌株所处的环境不同，相应的适应性改变也有所差异。缺陷菌株因无法激活Las 系统，影响中下游PQS 和Rhl 系统的功能，不利于绿脓菌素的生成。

本研究中两组菌株经不同PQS 诱导方案绿脓菌素活性变化有差异，其中正常组菌株在不同诱导方案下绿脓菌素活性呈不同程度地促进，缺陷组菌株在不同诱导方案下绿脓菌素活性变化不明显，缺陷组菌株绿脓菌素活性始终低于正常组。一方面说明lasR 可能在绿脓菌素的生成过程中发挥重要的作用，推测绿脓菌素的表达可能也受Las 系统调控；另一方面表明，PQS 信号分子虽然可促进绿脓菌素表达，但可能不是主要影响因素。对于这些推测尚需进行基因和蛋白水平的研究进一步验证。