纳豆激酶高产菌株的选育及其酶学活性研究

陈俊煌

（福建汇盛生物科技有限公司，福建漳州 363099）

纳豆激酶是一种含有275 个氨基酸、分子量为27 728 Da 的蛋白酶，具有溶血、抗血小板凝集、溶栓等多种活性特点，有助于预防高血压及动脉硬化[1]。纳豆激酶除了在预防、治疗心血管疾病方面有重要作用，相较于其他类别药物，具备更多的优点，如发酵生产成本低、食用安全、无过敏源性、有静脉注射或口服供选择等，在肠道中保持较强的稳定性。因此，纳豆激酶被认为是21 世纪口服溶血栓最具潜力的生物药物[2-3]。但在现有报道中纳豆激酶液体发酵酶活相对较低且酶活不稳定，制约了工业化大规模生产。

枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），是一类有益于人体生命健康的安全菌株，是一种在食品发酵、酶制剂及药品原料生产领域得到广泛应用的优良菌株[4-5]。周雪琴等[6]从鲜纳豆中分离筛选出一株枯草芽孢杆菌，优化发酵条件后生产出的纳豆激酶酶活可达393.09 U/mL。陈晓飞等[2]以保藏的固体发酵产纳豆激酶（NK）高活性菌株作为出发菌株，经紫外-亚硝基胍-60Co 复合诱变后，获得发酵产NK 高活性的菌株，活性最高为2 184.32 U/mL，是诱变前出发菌株的1.98 倍。

本文从豆制品废液沉淀池获取泥沙样，再经摇瓶液体发酵，纤维蛋白-琼脂糖平皿点样筛选，最终将溶解圈大、酶活性高的菌种分离出来，并从形态学、分子生物学以及酶学性质等方面对菌株进行鉴别和研究，旨在筛选出一株酶活高、性能稳定的纳豆激酶菌株，为降血栓药物、保健食品开发提供优良菌株资源和理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源

采集自豆制品废液沉淀池的淤泥样品。

1.1.2 培养基

（1）平皿培养基为LB 基础培养基+2%琼脂；（2）种子培养基为LB 基础培养基；（3）发酵培养基成分为2%可溶性淀粉+1%胰蛋白胨+0.5%酵母粉+0.1% KH2PO3+0.2% K2HPO3·3H2O+0.02% CaCl2。

1.1.3 仪器与试剂

PH50-3A43L-A 生物显微镜，凤凰光学股份有限公司；XD-202 倒置显微镜，南京江南永新光学有限公司；TGL-16 医用离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；PAX-150B 生化培养箱，宁波赛福实验仪器有限公司。

纤维蛋白原、凝血酶、尿激酶，中国食品药品检定研究院。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的分离纯化

样品采用稀释涂布法，37 ℃培养1 ～2 d。选取长势良好、形态单一、类似芽孢菌的单菌落，连续纯化3 次即可分离出纯培养单菌落。

1.2.2 菌株的鉴定

（1）形态学观察。根据相关文献，观察菌株的菌落形态、革兰氏染色及其芽孢染色[7-8]。

（2）分子生物学鉴定。使用DNA 提取试剂盒提取菌株DB-07 DNA，然后进行PCR 反应及跑胶，得到一条清晰、明亮的条带，送厦门铂瑞生物公司测序。BLAST 序列比对，并进行系统发育进化树的构建。

1.2.3 纤维蛋白-琼脂糖测定平皿的制备

取已灭菌的1.5%琼脂糖溶液10 mL 至烧杯中，50 ℃水浴，另外吸取10 mL 纤维蛋白原溶液（1.5 mg/mL）、760 μL 凝血酶溶液（1 bp/mL）分别在50 ℃水浴保温20 min。将上述药品混合均匀，无菌倒板，静置30 min 后置4 ℃冰箱保存。

1.2.4 粗酶液的制备

菌株接种发酵，37 ℃、150 r/min 培养48 h。离心收集上清，即得粗酶液。

1.2.5 酶活测定

1.2.5.1 尿激酶标准曲线的绘制

用0.9%氯化钠溶液对1000 IU/mL 尿激酶母液进行梯度稀释配制，得20 IU/mL、40 IU/mL、60 IU/mL、80 IU/mL、100 IU/mL 样品溶液。分别吸取5 μL 各浓度的尿激酶溶液在纤维蛋白-琼脂糖平皿2mm 孔中点样，然后正放于生化培养箱30 ℃培养16 h。X轴表示溶解圈面积，Y 轴表示尿激酶浓度，绘制标准曲线。

1.2.5.2 纳豆激酶酶活的测定

纳豆激酶的酶活以尿激酶活力（IU/mL）来定义。发酵液12 000 r/min 离心10 min，收集上清，生理盐水稀释50 倍，取5 μL 生理盐水稀释后的酶液在纤维蛋白-琼脂糖平皿上点样，正放置于生化培养箱30 ℃培养16 h，根据上述标准曲线测酶活。

1.2.6 纳豆激酶酶学活性研究

1.2.6.1 最适反应温度

在8 支5 mL 离心管中各加入500 μL 稀释至一定酶活的纳豆激酶溶液，在pH 自然条件下水浴30 min，研究20 ～55 ℃条件对纳豆激酶活性的影响，水浴结束立即放置冰浴10 min，平皿点样测定酶活，以最高酶活为100%进行组间比较。

1.2.6.2 最适反应pH

配制pH 分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 的酶液，在30 ℃条件下水浴30 min，水浴结束立即放置冰浴10 min，之后在平皿点样，以最高酶活为100%进行组间比较。

1.2.6.3 最适水浴时间

在最适反应温度和pH 条件下，水浴时间分别设置 为30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min，水浴结束后冰浴10 min，平皿点样，以最高酶活为100%进行组间比较。

1.2.6.4 不同金属离子对纳豆激酶酶学活性的影响

根据文献[1]设定金属离子浓度为10 mmol/L，在最适的温度、pH 及水浴时间条件下，研究Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+和Fe2+对纳豆激酶酶活的影响。以不添加金属离子时的最高酶活为100%，进行组间比较。

2 结果与分析

2.1 菌株的分离纯化

经过分离纯化获得的菌株，接种至摇瓶发酵培养48 h，发酵液离心收集上清液，在纤维蛋白-琼脂糖平皿中点样测定纳豆激酶酶活。比较菌株之间透明圈直径大小，选择透明圈直径大的菌株继续复筛，选育到一株芽孢杆菌，摇瓶酶活水平为3 097.63 IU/mL，编号DB-07。菌株DB-07 纳豆激酶溶解圈见图1（箭头所指部位）。

图1 纳豆激酶平皿溶解圈

2.2 菌株的鉴定

2.2.1 菌株的形态学观察

如图2 所示，菌株DB-07 在LB 平皿培养基中培养24 h，菌落形状不规则、白色、表面粗糙、无光泽、不透明、质地蜡状、扁平、边缘波状；该菌为G+，菌体短杆状；芽孢染色呈绿色、菌体呈红色，芽孢中生、短椭圆形。根据以上结果，初步判定DB-07 菌株归属于芽孢杆菌属（Bacillussp.）。

图2 菌株DB-07 形态特征

2.2.2 分子生物学鉴定

菌株DB-07 的16S rRNA 序列长度为1 459 bp，序列比对结果与B.subtilis有99.79%相似度，序列覆盖度为98%，系统发育进化树结果显示菌株DB-07与B.subtilis在同一分支上（图3）。因此，将菌株DB-07 鉴定为B.subtilis。

图3 DB-07 菌株的系统发育树

2.3 纳豆激酶活力测定

2.3.1 纳豆激酶酶活标准曲线

以尿激酶为标准品，制备纳豆激酶酶活标准曲线，见图4。

图4 纳豆激酶酶活标准曲线

2.3.2 纳豆激酶酶活的测定

测量溶解圈直径为4.17 mm，得到溶解圈面积为54.60 mm2，代入公式，计算出纳豆激酶的酶活为3 097.63 IU/mL。

2.4 菌株DB-07 的纳豆激酶酶学活性研究

2.4.1 菌株DB-07 的纳豆激酶最适温度

如图5 所示，随着温度的上升，纳豆激酶酶活呈现先升后降的趋势，温度30 ℃时酶活最高。随着温度的继续上升，酶活逐渐下降，说明高温环境不利于纳豆激酶酶活性质稳定。因此，菌株DB-07 的纳豆激酶的最适反应温度确定为30 ℃。

图5 温度对纳豆激酶酶学活性的影响

2.4.2 菌株DB-07 的纳豆激酶最适pH

如图6 所示，随着pH 值上升，酶活先升后降。当pH 值为6.5 时，纳豆激酶酶活达到最大值；pH 低于5.0 时，酶活快速降低，说明低pH 值不利于酶学活性的维持。因此，菌株DB-07 的纳豆激酶最适反应pH 确定为6.5。

图6 pH 对纳豆激酶酶学活性的影响

2.4.3 菌株DB-07 的纳豆激酶最适水浴时间

如图7 所示，随着水浴保温时间的增加，酶活先升后降，然后逐渐维持一定范围的酶学活性。水浴60 min 时酶活最高；从60 min 增加到90 min，相对酶活下降近30%，90 min 之后酶活逐渐稳定。从实验结果分析，在水浴保温时间相对较短情况下，对纳豆激酶能够起到激发酶学活性的作用，随着时间延长，酶活逐渐下降。因此，菌株DB-07 的纳豆激酶最适反应水浴时间确定为60 min。

图7 水浴时间对纳豆激酶酶学活性的影响

2.4.4 不同金属离子对菌株DB-07 纳豆激酶酶学活性的影响

如表1 所示，Ca2+和Cu2+能够提高菌株DB-07纳豆激酶的酶学活性，而Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+则会抑制纳豆激酶的酶学活性。因此，在应用中应避免体系中存在游离的Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+，可适当加入Ca2+和Cu2+。

表1 金属离子对纳豆激酶酶学活性的影响

3 结论

本研究从豆制品废液沉淀池的淤泥样品中分离筛选到一株产纳豆激酶菌株DB-07，该菌株发酵上清液在纤维蛋白-琼脂糖平皿培养后具有明显的溶解透明圈。经菌落形态学和分子生物学鉴定，鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）。

枯草芽孢杆菌DB-07 在摇瓶中37 ℃、150 r/min培养48 h，纳豆激酶酶活力达到3 097.63 IU/mL。纳豆激酶在温度30 ℃、pH 值6.5、水浴时间60 min 条件下，能够保持较高的活性，Ca2+和Cu2+能够提高纳豆激酶的酶学活性，而Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+则会抑制纳豆激酶的酶学活性。本研究获得的菌株DB-07 是一株能够高产纳豆激酶的枯草芽孢杆菌，可为降血栓药物、保健食品的开发提供优良的菌株资源。