人参多糖联合槲皮素对DSS 诱导小鼠溃疡性结肠炎的保护作用

饶 敏，孙智辉，马占川，徐华丽，睢大筼，高普均

（1.吉林大学第一医院，长春 130021；2.吉林大学药学院，长春 130021）

溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）是一种易反复发作的非特异性肠病，具有病程长、治愈难度大、易致癌的特点， 被世界卫生组织列为现代难治性疾病之一。目前治疗主要包括非特异性抗炎和免疫抑制药物[1]。 中药可通过调节炎症细胞因子、肠道菌群、免疫系统及保护肠黏膜来治疗UC，相比西药更安全，抗炎、调节免疫的效果更好[2]。

人参多糖（Ginseng polysaccharide，GPS）是五加科人参属植物人参（Panax ginsengC.A. Mey.）成熟果实中最重要的活性组分之一， 主要成分为淀粉样葡聚糖、RG-Ⅰ型果糖、HG 型果糖、AG 型果糖， 具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗糖尿病等活性[3]。佟彤等人通过环磷酰胺免疫抑制模型和刀豆蛋白A 肝炎模型，研究了人参多糖对小鼠的免疫调节作用， 结果表明，人参多糖在两种模型中均能发挥良好的免疫调节作用[4]。刘春红课题组考察了人参多糖的免疫调节作用，研究了植物乳杆菌C88 与人参多糖的联合作用，借助酶联免疫吸附实验对小鼠血清中IL-2、TNF-α 等相关生化指标进行了检测，结果发现联合用药组表现出更明显的免疫调节作用[5]。槲皮素（quercetin，QT）又名槲黄素、栎精，属黄酮类化合物，主要以苷的形式存在。 现代药理研究表明，槲皮素可显著增强环磷酰胺造成的免疫低下小鼠的免疫功能，可使外周血白细胞计数、脾指数、T 淋巴细胞增殖率均升高，CD4 比例及CD4/CD8 比值升高，淋巴细胞凋亡比率降低[6]。 槲皮素可有效保护系统性红斑狼疮模型小鼠的肾脏功能，并改善其免疫功能[7]。 那么，GPS 与QT 的免疫调节及抗炎活性是否对UC 具有协同治疗作用呢？ 本文建立DSS 诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型，观察二者联合应用的协同作用，为其开发利用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 动物

Balb/c 小鼠，雄性，体重20～22g，由辽宁长生生物技术股份有限责任公司提供， 质量合格证号：SCXK-（辽）2020-0001。

1.2 药品及试剂

人参多糖由东北师范大学生命科学学院提供，批号：20200510，以双蒸水配制成所需浓度；槲皮素由吉林大学化学学院提供，纯度>98%，批号：20221025，以0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）配制成所需浓度；柳氮磺吡啶由上海福达制药有限公司提供， 批号：20221010，以0.5% CMC-Na 配制成所需浓度；MDA、SOD、CAT、GSH-Px、IL-6、IL -1β、IL -18、IFN -γ 及TNF-α 测试盒均由南京建成生物工程研究所提供，批号：20230315。

1.3 实验方法

50 只雄性Balb/c 小鼠随机分为对照（Con）组，模型（DSS）组，人参多糖（GPS）联合槲皮素（QT）低、高剂量组及阳性药柳氮磺吡啶（SASP）组，每组10 只。 除对照组外， 各组小鼠自由饮用3%葡聚糖硫酸钠（DSS） 造模，GPS+QT 低、 高剂量组分别先后灌胃GPS+QT 50+50、100+100 mg/kg，SASP 组灌胃SASP 500 mg/kg，Con 组与DSS 组灌胃等量0.5% CMC-Na，灌胃体积均为20 mL/kg，每天2 次，连续7 天。 于造模7 天后腹腔注射戊巴比妥钠30 mg/kg 麻醉， 处死小鼠，取结肠组织HE 染色观察结肠病理变化；ELISA试剂盒检测结肠组织白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-18（IL-18）、干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量；生化试剂盒检测结肠组织超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）、过氧化氢酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）含量。

1.4 统计处理与数据分析

2 结果

2.1 对小鼠结肠组织病理形态学的影响

结肠组织HE 染色结果显示，Con 组隐窝结构完整清晰，无炎症细胞浸润。 DSS 组结肠组织广泛深度损伤，可见隐窝扭曲，炎症细胞浸润增加，部分出现结肠黏膜及黏膜下层侵蚀和溃疡。GPS+QT 50+50 mg/kg剂量组炎症细胞浸润减少，部分隐窝结构完整。 GPS+QT 100+100 mg/kg 剂量组和SASP 500 mg/kg 组小鼠结肠浸润性炎症细胞明显减少，结肠炎严重程度显著降低，结果见图1。

图1 对小鼠结肠组织病理形态学的影响（HE 染色）

2.2 对小鼠结肠组织炎症相关细胞因子的影响

与Con 组比较，DSS 组结肠组织IL-1β、IL-6、IL-18、IFN-γ 及TNF-α 含量均明显升高 （P＜0.01）；与DSS 组比较，GPS+QT 50+50、100+100 mg/kg 剂量组及SASP 500 mg/kg 组均能明显降低结肠组织IL-1β、IL-6、IL-18、IFN-γ 及TNF-α 含量 （P＜0.05 或P＜0.01），结果见表1。

表1 联合用药对小鼠结肠组织炎症相关细胞因子的影响（±s，n=10）

与对照组比较##P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

?

2.3 对小鼠结肠组织氧化应激相关指标的影响

与Con 组比较，DSS 组小鼠结肠组织SOD、CAT及GSH-px 活性均明显降低，MDA 含量明显增加（P＜0.01）；与DSS 组比较，GPS+QT 50+50、100+100 mg/kg剂量组及SASP 500 mg/kg 组小鼠结肠组织SOD、CAT及GSH-px 活性均明显增加（P＜0.05 或P＜0.01），MDA含量明显减少（P＜0.05 或P＜0.01），结果见表2。

表2 联合用药对小鼠结肠组织氧化应激相关指标的影响（±s，n=10）

表2 联合用药对小鼠结肠组织氧化应激相关指标的影响（±s，n=10）

与对照组比较##P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

?

3 讨论

DSS 是诱导结肠炎的常用方法，肠道炎症的严重程度可通过改变DSS 浓度和给药频率加以调整。C57BL/6 品系小鼠造模的DSS 剂量通常为1.5%至3.0%，BALB/c 品系小鼠造模的DSS 剂量通常为2.5%和5.0%[8]。 本文选择通过小鼠自由饮用3%的DSS 水溶液制作UC 模型，时间长度为7 天[9]。 据报道，雄性鼠更容易发生无上皮化的溃疡[10]，本文采用雄性鼠作为实验动物。

与健康人相比，UC 患者肠黏膜有不同程度的溃疡，炎症细胞浸润增加，固有层浅表部分有浆细胞、T淋巴细胞、B 淋巴细胞、巨噬细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞的浸润，隐窝出现炎症变化，隐窝脓肿数量增加。 随着疾病进展，炎性细胞浸润从固有层浅部扩散到结肠深层，随后累及整个肠道组织，所有细胞浸润趋势增加[11]。 本实验结果显示，DSS 组小鼠结肠组织出现广泛深度损伤，可见隐窝扭曲，炎症细胞浸润增加，部分出现结肠黏膜及黏膜下层侵蚀和溃疡。 GPS与QT 联合应用可使结肠浸润性炎症细胞明显减少，结肠炎严重程度显著降低，表明可保护结肠组织的病理性损伤。

UC 造成结肠组织损伤的原因之一是过度激活的炎症反应。高表达的细胞因子介导了炎性细胞和非免疫细胞之间的病理性互相作用，促炎因子IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α 与抗炎因子之间的失衡是结肠炎致病原因之一[12]。 疾病状态下，共生菌群衍生的脂多糖会导致中性粒细胞浸润， 进一步产生大量的IL-1β，以依赖性方式诱导肠道单核吞噬细胞产生IL-6[13]，IL-6 在DSS 诱导的结肠炎小鼠中升高最为显著，对下游酶及其他通路有调节作用，IL-6 和TNF-α 会导致结肠炎进一步发展[14]。 临床数据证明，肠道中IFNγ 水平增加对肠道有致病作用[15]。 IL-18 的释放可以介导杯状细胞损失以诱导结肠炎发展， 并干预T 细胞介导的结肠炎[16]。 本实验结果显示，DSS 组小鼠结肠组织IL-6、IL-1β、IL-18、IFN-γ 和TNF-α 含量显著升高，GPS 与QT 联合应用可使结肠组织上述炎症因子含量明显降低，表明可通过调节炎症细胞因子减少结肠组织的损伤。

UC 造成结肠组织损伤与氧化应激密切相关，体内抗氧化酶SOD、CAT 及GSH-Px 等在UC 发生发展中起重要作用[17]。 本实验结果显示，DSS 组小鼠结肠组织MDA 含量明显上升，SOD、CAT 及GSH-Px 活性明显下降，GPS 与QT 联合应用可使结肠组织MDA含量明显下降，SOD、CAT 及GSH-Px 活性明显上升，表明可通过对抗氧化应激损伤保护结肠组织。