经典名方温胆汤指纹图谱研究

付成国，张 颖，张美琪，李 双，高 嵩，徐 建，鄢必新

（吉林修正药业新药开发有限公司，吉林省中药标准化关键工程技术重点实验室·吉林 长春·130103）

温胆汤出自唐代孙思邈《备急千金要方》，方曰：“治大病后，虚烦不得眠，此胆寒故也，宜服此温胆汤方”[1]。 该方由清半夏、竹茹、麸炒枳实、陈皮、生姜、炒甘草共6 味药材组成。 传统功能主治脾胃不和，痰热内扰之虚烦不眠，或呕吐呃逆，或惊悸不宁可等症。现代研究表明其对神经系统、心血管系统、消化系统和呼吸系统等疾病均有一定的疗效[2]。中药指纹图谱可以科学、系统、全面地反应中药的复杂化学成分组成[3]，指纹图谱技术应用日益广泛，不仅应用于中药的含量测定，还是对中药已知成分和未知成分进行整体评价和分析的质量控制方法。 指纹图谱技术已经成为中药材和制剂控制质量的重要手段之一。 有关温胆汤指纹图谱的研究报道较少[4]，本文通过HPLC 法建立了10 批温胆汤的指纹图谱，并采用相似度评价软件，客观地反映了温胆汤化学成分的整体性、复杂性及质量差异，为温胆汤的物质基础研究提供了实验依据[5-8]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

戴安U3000 高效液相色谱仪， 赛默飞世尔科技（中国）有限公司；MS105DU 型电子天平，梅特勒-托利多公司；TOLEDO XPR2 型百万分之一分析天平，梅特勒-托利多公司；SB25-12DT 型超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 试剂与试药

1.2.1 试药

温胆汤样品 （批号：230101 ～230105；230201 ～230205），均由修正药业集团股份有限公司提供；甘草苷（批号：111610-201607）、 柚皮苷（批号：110722-202116）、芸香柚皮苷（批号：2014-0025）、橙皮苷（批号：110721-202019）、 新橙皮苷 （批号：111857-201804）、甘草酸铵（批号：110731-201418）、6-姜辣素（批号：111833-202007），中国食品药品检定研究院。

1.2.2 试剂

乙腈为色谱纯；甲醇、甲酸、磷酸，均为分析纯；水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX SB C18色谱柱 （柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm )；以乙腈为流动相A，以0.3%磷酸溶液为流动相B，按下表中规定进行梯度洗脱；检测波长为237nm；柱温为25℃；流速1ml/min，进样量为10μL。 理论板数按柚皮苷峰计算应不低于10000。

时间（分钟）流动相A（%）流动相B（%）0～1412→2088→80 14～1520→1580→85 15～191585 19～2015→2085→80 20～352080 35～5020→7280→28 50～6072→1228→88

2.2 对照品溶液的制备

取甘草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草酸铵、6-姜辣素，精密称定，分别加甲醇制成每lml 含20μg 的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取温胆汤样品1g， 置具塞锥形瓶中， 精密加入50%甲醇15ml， 称定重量， 超声处理30 分钟 （功率250W，40KHz），放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察[9-10]

2.4.1 精密度试验

精密吸取“2.3”项下的供试品溶液10μL，按照“2.1”项下的色谱条件和指纹图谱测定方法，连续进样6 次，进行测定，记录指纹图谱数据，选取柚皮苷作为参照峰（S 峰），计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，分别考察其RSD 值，结果相对保留时间RSD均小于0.5%，相对峰面积RSD 均小于5.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验

取同一批供试品（批号：230204），按“2.3”项下方法制备6 份供试品溶液，按照“2.1”项下的色谱条件进行测定，选取柚皮苷作为参照峰（S 峰），计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积。 分别考察其RSD值，结果相对保留时间RSD 均小于0.5%，相对峰面积RSD 均小于5.0%，表明该方法的重复性较好。

2.5 指纹图谱的建立

2.5.1 参照物选择

指纹图谱的参照物主要用于考察指纹图谱的稳定性和重现性，并有助于色谱峰的辩认，起着辩认和评价色谱指纹图谱共有峰的指引作用。在温胆汤指纹图谱色谱图中，因柚皮苷峰（7 号峰）其保留时间适中，峰面积较大，分离度较好，所以选为参照峰（S 峰）。

2.5.2 共有模式的建立

取10 批温胆汤样品， 批号分别为 （230101－230105；230201－230205），分别进行检测，结合重复性试验结果，去除相对峰面积较小、峰形不佳等易受影响，导致检测结果不稳定的色谱峰。将10 批样品测定指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，经多点校正，将色谱峰匹配，生成对照图谱，确定15 个指纹峰。 10 批样品指纹图谱相似度均大于0.9。 其相对保留时间和相对峰面积结果分别见表1 和表2。

表1 10 批样品相对保留时间考察结果

表2 10 批样品相对峰面积考察结果

2.5.3 峰指认

取甘草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草酸铵、6-姜辣素适量，精密称定，分别用甲醇制成每lml 含20μg 的溶液，依法测定。 通过上述对照品色谱峰进行指认。结果表明，峰4 为甘草苷、峰5 为芸香柚皮苷、峰7 为柚皮苷、峰8 为橙皮苷、峰9 为新橙皮苷、峰12 为甘草酸铵、峰13 为6-姜辣素。

3 结论

建立了温胆汤指纹图谱测定方法， 确定了15 个指纹峰，分别指认了7 个指纹峰。 建立的指纹图谱方法能有效表征温胆汤的质量情况，是成品质量控制方法的提升和完善，能全面有效地控制产品质量，结果见图1。

图1 10 批温胆汤指纹图谱叠加图及其对照指纹图谱（R）

4 讨论

在不同检测波长[11]（237nm、257nm、283nm、327nm）下分别进样检测， 分析后发现在237nm 时色谱峰出峰较多， 各峰比例和峰型较佳， 分离度好， 故选择237nm 作为检测波长进行后续检测。 分别考察了乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.3%磷酸水等流动相梯度洗脱系统，结果表明，以乙腈-0.3%磷酸水为流动相梯度洗脱，色谱峰基线噪音小，峰型好，分离效果最佳，确定乙腈-0.3%磷酸水为流动相。实验中10 批样品的批号分别为（230101－230105；230201－230205），在10 批样品中，15 个共有峰中未标定的成分， 有待进一步采用对照品或液-质联用技术进一步分析确定，为后续建立经典名方温胆汤的质量控制标准及药效物质基础研究提供参考[12-13]。