基于铁死亡相关基因表达构建肝细胞癌患者临床预后模型

赵爽，熊号峰，侯斐，张译之，亢倩，孙丽莹

（首都医科大学附属北京友谊医院重症肝病科，肝病中心，首都医科大学附属北京友谊医院肝脏移植中心，首都医科大学附属北京友谊医院国家消化系统疾病临床医学研究中心，北京 100091）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，约占原发性肝癌的75%～85%，是癌症死亡的第四大原因［1］。尽管手术切除、消融、栓塞、靶向药物治疗、免疫治疗、化疗等各种治疗手段越来越多，但肝细胞癌患者的生存率仍然很低，由于治疗耐药和肿瘤复发，5 年生存率仍低于20%［2］。肝移植是肝细胞癌根治性治疗手段之一，中国肝移植注册中心数据显示：2018 — 2020 年国内肝移植数量平均6000 例/年，其中肝癌肝移植占比35%［3］。肝细胞癌是一种高度异质性疾病，这使得预后预测具有挑战性。在个体水平上评估死亡风险仍然很困难，因此临床迫切需要建立一个可靠的预测模型来进行风险分层和预后预测。

铁死亡是一种铁依赖性的，区别于细胞凋亡、细胞坏死、细胞自噬的新型细胞程序性死亡方式，由脂质过氧化驱动［4-5］。铁死亡的核心事件包括铁积累增加、脂质修复系统受损和脂质过氧化，最终导致膜破坏和细胞死亡［6］。诱导铁死亡已成为引发癌细胞死亡的有希望的治疗方法，特别是对于对传统治疗有抗药性的恶性肿瘤［7-8］。

近年来，铁死亡在肝脏疾病领域迅速受到关注，因为肝脏容易受到氧化损伤，铁超载是大多数肝脏疾病的主要特征［9］。研究表明，铁死亡在肝细胞癌中起着至关重要的作用，现有研究主要集中在索拉非尼诱导的铁死亡及其潜在调节靶点。研究发现一些铁死亡相关基因，如Rb［10］、NRF2［11］和MT1G［12］，可能会保护肝细胞癌抵抗索拉非尼诱导的铁死亡。然而，铁死亡相关基因是否与肝癌患者预后相关在很大程度上仍然未知。此外，铁死亡与肝移植缺血/再灌注密切相关，研究者发现铁过载可以加重移植后缺血/再灌注损伤，与肝脏对缺血/再灌注损伤的敏感程度有关［13］。因此，更深入地了解铁死亡相关基因在肝细胞癌患者中的作用和相关机制可能有助于临床实践中的风险分层和个体治疗选择。

本研究分析了铁死亡相关基因的预后能力和铁死亡影响HCC 预后的潜在机制，并对肝移植后缺血/再灌注损伤中铁死亡相关基因表达变化进行了初步探讨。我们构建了基于铁死亡相关基因的风险模型来评估HCC 的预后，旨在帮助促进肝细胞癌患者的分级和个体化治疗。

1 资料与方法

1.1 研究对象：HCC 患者的肝组织转录数据和相应的临床信息从TARGET 数据库下载［14］。共收集358 个HCC 样本肝组织转录组数据及相匹配的临床信息，包括生存时间、生存状况、年龄、性别和TNM分期。铁死亡相关基因集从FerrDb 数据库获取。5 例无缺血肝移植［15］和5 例传统肝移植患者的肝穿组织转录组数据（GSE113024）从GEO 数据库下载。

1.2 HCC 患者分子亚群的鉴定：行单变量Cox 回归以筛选与HCC 总生存期相关的基因。然后与铁死亡相关基因集取交集，筛选出与预后相关的铁死亡相关基因，最后根据预后相关铁死亡基因的表达矩阵使用共识聚类进行聚类分析。并根据一致性累积分布函数图和曲线下面积图以及样本聚类一致性分析选择确定聚类数。

1.3 差异表达基因的筛选及通路分析：使用R 包“Limma”进行微阵列数据线性模型分析，以识别亚组之间的差异表达基因［16］。随后，使用R 包“cluster Profiler”基于差异表达基因进行KEGG 通路富集分析。

1.4 建立风险预测模型：使用“glmnet”R 包基于前面筛选的铁死亡预后相关基因进行LASSO-Cox回归［17］。根据最小λ 确定风险预测模型的候选基因。然后进行多变量Cox 回归以筛选构建模型的基因。风险模型最终提供风险评分，根据中位数将患者分为高风险组和低风险组。通过绘制列线图以可视化该风险预测模型，并绘制时间相关受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic，ROC）和校准曲线，以评估预测效率并验证模型的准确性。

1.5 统计学分析：使用R studio（版本4.0.3）和GraphPad 进行统计分析。对于正态分布数据，应用student's t 检验，对于非正态分布数据，使用Wilcox 检验。分类数据采用χ2检验。使用Kaplan-Meier 方法进行生存分析。使用对数秩检验计算生存时间差异的显著性。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基于铁死亡相关基因的HCC 分子亚群一致性聚类：为了研究铁死亡相关基因在HCC 患者中的预后意义，我们使用TARGET 数据库中358 个HCC 患者肝组织转录组数据，通过单因素Cox 回归筛选出了与预后相关的基因，再通过与铁死亡相关的基因的交集，共筛选到153 个与HCC 预后有关的铁死亡相关基因。

一致性聚类是一种为确定数据集中可能的聚类数量和成员提供定量证据的方法，可以发现具有生物学意义的聚类，并广泛应用于癌症分子亚类鉴定。基于上述筛选出的153 个预后相关铁死亡相关基因进行了一致性聚类。综合分析一致性累积分布函数图、曲线下面积图以及样本聚类一致性图，选择了聚类数k=2，将患者分为了两个亚组（C1、C2）（图1 A-D）。热图显示，两个分子亚群之间铁死亡相关基因的表达显著不同（图1E）。更重要的是，生存分析图表显示，两组之间患者总生存期有显著差异（图1F，表1），两组之间年龄、性别没有明显差异（表1）。这些结果表明，铁死亡相关基因可以将HCC 患者分为两个具有不同总生存期的分子亚组。

表1 肝癌患者两个分子亚组的一般资料对比

图1 基于铁死亡相关基因的肝细胞癌分子亚群的一致性聚类分析

2.2 基于两个分子亚组之间的差异表达基因的通路富集分析：我们进一步分析了两个分子亚组之间的差异表达基因，以进一步探索铁死亡相关基因参与肝细胞癌预后的可能机制。火山图显示了差异倍数＞1.5 倍，P ＜0.05 条件下两组之间的差异表达基因（图2A）。

图2 两个分子亚组之间的差异表达基因

我们进一步对两个分子亚组之间的差异表达基因进行了KEGG 通路富集，结果表明富集到Th1 、Th2、Th17 细胞分化、T、B 细胞受体信号通路、细胞因子-细胞因子受体相互作用、趋化因子信号通路、细胞周期、炎症介质调节、胆汁分泌等KEGG 通路（图2B）。上述结果提示铁死亡相关基因可能通过影响患者免疫微环境及胆汁酸代谢参与肝细胞癌的预后转归。

2.3 构建模型的铁死亡基因筛选：为了构建风险模型，我们评估了肝细胞癌患者中差异铁死亡相关基因的预后预测能力。LASSO-Cox 回归将12 个LMRG 确定为风险模型的潜在候选者（图3A B）。随后我们通过多变量Cox 回归从其中确定了6 个基因（KLF2、MYCN、FZD7、PRDX6、HILPDA、SLC7A11）作为风险模型的最终基因组合（图3C）。最后，我们构建了预后风险模型如下：Risk Score = 0.29667926×MYCN -0.4078465×KLF2+0.3 7424548×FZD7+ 0.45779341×PRDX6+0.30693856×HILPDA+0.26201538×SLC7A11。该模型总体的预后差异显著性logtest=1.47071078672503e-13，sctest=1.4790442467149e-17，waldtest=5.11123236475942e-16，C-index 为0.747596243085719。

图3 建立基于铁死亡相关基因的风险模型

上述研究结果表明，基于铁死亡基因构建的风险模型可以将HCC 患者分为具有不同总生存期的高风险和低风险组（图3 D、E）。如图3D 所示，MYCN、FZD7、PRDX6、HILPDA 和SLC7A11 的表达随着风险评分的增加而升高，而KLF2 的高表达预测HCC 患者的死亡风险较低。

2.4 风险模型在不同临床亚组中均可以预测肝细胞癌患者的死亡风险：我们进一步评估了该风险模型在HCC 患者不同临床亚群中的预测能力。我们发现，该风险模型在不同性别、年龄、TNM 分期的患者中所区分出的高风险组和低风险组的生存率有明显的差异（图4）。研究表明，构建的风险模型在不同的临床亚组中表现出可靠的预测能力。

2.5 预测模型可视化及评价：我们使用列线图对预测模型进行了可视化（图5A）。并对模型进行了校准分析，以评估列线图的预测准确性，结果显示预测和观测数据之间存在一致性（图5B）。ROC 曲线显示：1、3、5 年的曲线下面积分别为0.81、0.83、0.89（图5C）。这些结果表明，我们构建的基于铁死亡相关基因的预测模型可以较好地预测HCC 患者的死亡风险。

图5 列线图的构建和模型评价

2.6 肝移植缺血/再灌注中铁死亡相关基因表达差异：我们进一步分析了无缺血肝移植和传统肝移植患者肝穿组织差异表达基因，以研究铁死亡相关基因在缺血/再灌注损伤中表达的变化。热图显示了差异倍数＞1.5 倍，P ＜0.05 条件下两组之间的铁死亡相关差异表达基因（图6）。

图6 缺血/再灌注损伤中铁死亡相关基因的差异表达

3 讨 论

HCC 是一种侵袭性癌症，病死率高，仍然是一个全球性的健康威胁。在这项研究中，HCC 患者被分为两个基于铁死亡基因的分子亚组，并构建了基于铁死亡相关基因的HCC 预后预测风险模型，有助于HCC 的分级诊断和治疗。

作为一个新的领域，肿瘤中的铁死亡在过去几年中受到了关注，越来越多的证据表明其可以影响肿瘤的发病和进展。我们基于铁死亡相关基因使用共识聚类法确定了HCC 患者的两个分子亚群，两个亚群有明显不同的生存率。我们的结果表明，铁死亡基因表达的失调可能与HCC 患者预后有关。

为了进一步阐明铁死亡参与HCC 预后的潜在机制，我们对两个分子亚群的差异表达基因集行了KEGG 通路富集分析，并富集到了Th 细胞分化、T、B 细胞受体等免疫相关通路及胆汁酸代谢通路。微环境中的免疫相关细胞对HCC 的发展和进展有重大影响，并受到越来越多的关注［18］。先前的研究发现，肝脏中浸润的记忆B 细胞［19-20］、Th17［21］和Th2［22］的丰度增加与HCC 的不良预后相关。Th2 细胞因子抑制肿瘤监视［23］，而Th17 细胞具有促进HCC 发展的潜力［22］。另外，胆汁酸代谢的稳态对保护肝脏至关重要［24］，使BAs 成为肝脏疾病的潜在生物标志物［25］。越来越多的证据表明，胆汁酸代谢与肝细胞癌的进展和预后有关［26-29］。胆汁酸水平的改变不仅会导致代谢紊乱、肝脏炎症、氧化应激和纤维化，还会引起对凋亡的抵抗，从而促进肿瘤发生和进展［30］。基于上述结果，我们推测铁死亡可能会通过改变HCC 的免疫微环境及影响胆汁酸代谢，从而参与HCC 的临床转归。

为了进一步验证铁死亡对HCC 预后的预测潜力，我们筛选了6 个铁死亡相关基因（KLF2、MYCN、FZD7、PRDX6、HILPDA、SLC7A11） 构建了一个风险预测模型，并使用列线图进行模型的可视化。列线图的校准分析及ROC 曲线结果表明该基因对HCC 预后具有较好的预测能力。另外，该风险模型在不同性别、年龄、TNM 分期和肿瘤状态的HCC 患者中均可以较好预测患者的死亡风险。这些结果表明，我们构建的基于铁死亡相关基因的预测模型可以较好地预测HCC 患者的死亡风险。

肝移植是HCC 根治性治疗手段之一，肝移植后再灌注损伤可能导致严重并发症，如移植后肝功能衰竭、缺血性胆道病变和再灌注后综合征等。铁死亡与肝移植缺血/再灌注损伤密切相关，铁过载是肝移植后肝损伤的独立危险因素［13］。我们的研究发现肝移植后缺血/再灌注损伤中存在明显的铁死亡相关基因表达改变。因此，HCC 患者铁死亡相关基因表达，有望成为评估患者对缺血/再灌注损伤敏感性和移植后缺血/再灌注损伤严重程度的新指标。

本研究存在一定的局限性。首先，预测模型需要进一步的在更大的队列及前瞻性队列中进行验证，其次，铁死亡影响HCC 预后的具体机制还有待进一步的阐明。最后，对于铁死亡相关基因在肝移植缺血/再灌注损伤中发挥的作用及机制还需进一步的研究。综上所述，我们基于铁死亡相关基因构建了临床预后风险模型，并初步探索了铁死亡参与HCC 预后的可能机制以及在肝移植后缺血/再灌注损伤中的表达变化。进一步探索铁死亡参与HCC 预后的潜在机制以及其在肝移植后缺血/再灌注损伤中的作用，可能发现HCC 治疗和肝移植后缺血/再灌注损伤治疗的新靶点。