巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠的构建及鉴定

黄庆 甄兰 赵桂霖 赵汝舟 叶新萍 吴飞翔，4，5

作者单位：530021 南宁1广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科；100850 北京2军事医学研究院生物工程研究所；

410007 长沙3湖南中医药大学第一附属医院体检中心；530021 南宁4广西肝癌诊疗工程技术研究中心；

530021 南宁5区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室（广西医科大学）

高尔基体蛋白73（golgi protein 73，GP73）是由KLADNEY 等［1］于2000 年发现的一种定位于高尔基体的Ⅱ型跨膜蛋白。GP73 包含一个N 端胞质结构域、一个跨膜结构域及一个C 端卷曲螺旋结构域，距离N 端55 位氨基酸处存在一个可被弗林蛋白酶（furin）识别并切割的位点，切割后可将GP73 从细胞中释放出来［2］。研究表明，GP73 在肝癌等多种肝脏疾病中显著升高，可作为肝脏疾病的血清标志物［3-4］。在胰腺癌细胞中GP73 高表达可诱导细胞上皮-间质转化，促进其侵袭、迁移和转移［5］；在胃癌中GP73 表达下调且与肿瘤分化密切相关［6］；GP73 也能通过激活TGF-β1/Smad2 信号通路促进膀胱癌细胞侵袭和转移［7］。此外，有研究团队发现GP73 可以调节巨噬细胞的极化状态［8］；GP73 通过刺激邻近巨噬细胞内质网应激激活，从而使巨噬细胞释放参与肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAM）表型的细胞因子和趋化因子，且阻断GP73 可降低TAM 的密度，抑制肿瘤生长以及延长生存期［9］。然而，GP73 的病理及生理功能尚未完全清楚，有关巨噬细胞中GP73相关功能的研究甚少，其在肿瘤性疾病中的作用和机制亟待探究。

Cre/LoxP 重组系统是由STERNBERG 等［10］于1981 年提出的一种位点特异性重组系统，包含Cre 重组酶和LoxP 位点两部分。LoxP 位点为P1 噬菌体上一长34 bp的碱基序列，该位点可被Cre重组酶特异性识别。在目的基因两侧插入LoxP 位点的过程称之为flox 修饰，当位于同一DNA 链上的2 个LoxP 位点方向相同时，将介导2 个LoxP 位点之间的DNA 序列特异性缺失［11］。小鼠溶菌酶基因（lysozyme 2，Lyz2）主要在巨噬细胞、单核细胞和粒细胞等髓系细胞中表达，负责编码溶菌酶M（lysozyme M，LysM）［12］。通过将Cre 重组酶插入小鼠Lyz2基因起始密码子处，得到Lyz2基因Cre 阳性小鼠，再将其与flox 修饰的GP73小鼠杂交，从而构建出巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠。本研究采用Cre/LoxP 重组系统构建巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠，同时在基因组和蛋白水平对其进行鉴定分析，为进一步研究GP73调控巨噬细胞功能在肿瘤性疾病中发挥的作用和机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

6～8 周龄SPF 级C57BL/6J 背景GP73flox/+小鼠及Lyz2-Cre+小鼠各3 只，均为雄性1 只和雌性2 只，体质量20～25 g，均购自上海南方模式生物科技股份有限公司（动物合格证号：SYXK泸2023-0005）。所有实验动物按照SPF 级动物饲养标准进行饲养，饲养环境温度20～24 ℃，相对湿度40%～60%，昼夜各半循环照明，自由饮水进食。本研究符合广西医科大学实验动物伦理学要求（伦理审批号：LW2023123）。

1.2 实验试剂

小鼠组织直接PCR 试剂盒购自美国Bimake 生物科技有限公司；DNA 分子量标准购自北京博迈德基因技术有限公司；核酸染料购自北京康润诚业生物科技有限公司；总RNA 提取试剂盒购自德国MACHEREY-NAGEL 公司；反转录试剂盒、Perfect-Start®Green qPCR SuperMix 购自北京全式金生物技术有限公司；BCA 蛋白检测试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；小鼠GP73抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；β-tubulin 抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；HRP标记的山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；NP40 裂解液、5×SDS 上样缓冲液购自北京索莱宝生物科技有限公司；Super ECL Detection Reagent购自上海翌圣生物科技有限公司。

1.3 小鼠的构建与繁殖

GP73flox/+小鼠由上海南方模式生物科技股份有限公司构建。应用Cre/LoxP 技术将LoxP 位点设置于GP73基因4 号外显子区域两端，对小鼠GP73基因进行flox 修饰，从而构建出GP73flox/+小鼠（图1A）。将GP73flox/+小鼠雌雄自交，子代得到GP73flox/flox小鼠。将GP73flox/flox小鼠与Lyz2-Cre+小鼠杂交，子代得到GP73flox/+Lyz2-Cre+小鼠，将其与GP73flox/flox小鼠杂交，最终得到基因型为GP73flox/floxLyz2-Cre+的巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠（macrophageGP73knockout mice，MKO小鼠）；GP73flox/floxLyz2-Cre-小鼠作为对照组小鼠，后续称为GP73fl/fl小鼠（图1B）。

图1 巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠构建与繁殖Fig.1 Construction and reproduction of macrophageconditional GP73 gene knockout mice

1.4 小鼠基因组DNA的提取、扩增及鉴定

1.4.1 鼠尾DNA提取 剪取3～8周龄小鼠尾尖2～5 mm置于1.5 mL EP管，每支EP管加入100µL新配置的组织消化液，55 ℃金属浴消化15 min，95 ℃金属浴孵育5 min，12 000 r/min 离心10 min。将上清液转移至新的EP管中涡旋振荡，-20 ℃储存备用。

1.4.2 PCR扩增及产物鉴定 PCR反应体系（20µL）：2×M-PCR OPTI™Mix 10 µL，正反向引物各1 µL（10µmol/L），DNA 模板2µL，去离子水6µL。引物序列见表1。PCR 反应程序：flox 基因型扩增程序为94 ℃3 min；94 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃30 s，35 个循环；72 ℃5 min；12 ℃30 min。Lyz2-Cre 基因型扩增程序为94 ℃3 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃1 min，35个循环；72 ℃5 min；12 ℃30 min。将以上鼠尾基因组PCR 扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳（135 V，30 min），电泳完成后使用凝胶成像仪拍摄并分析结果。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.5 巨噬细胞GP73基因敲除效果验证

1.5.1 骨髓来源巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages，BMDMs）分离和培养 选取6～8 周龄GP73fl/fl和MKO 小鼠各6 只，异氟烷过量麻醉处死小鼠后，置于超净台中分离股骨和胫骨，用10 mL 预冷的DMEM培养基反复冲洗骨髓细胞，经细胞筛过滤后，4 ℃、1 500 r/min 离心3 min，弃去上清液；吸取适量红细胞裂解液重悬沉淀，静置1～2 min，4 ℃、1 500 r/min 离心3 min，弃去上清液。重悬细胞沉淀后接种至含DMEM 培养基+10%胎牛血清+20 ng/mL M-CSF 的培养皿，每3 d换液，第7天即为成熟的BMDMs。

1.5.2 腹腔原位巨噬细胞（peritoneal macrophages，PM）分离培养 选取6～8周龄GP73fl/fl和MKO小鼠各6只，吸取适量预冷的1640 培养基注入小鼠腹腔，轻揉小鼠腹部1～2 min，用注射器将小鼠腹腔液吸出并转入离心管中，4 ℃、1 500 r/min 离心3 min，弃去上清液，用适量1640 完全培养基重悬细胞沉淀接种至培养皿中培养。

1.6 qPCR检测GP73基因表达水平

将培养完成后的BMDMs 及PM 的培养基弃去，PBS清洗3次后加入适量RNA提取试剂，提取总RNA，测定浓度及纯度后行反转录。反转录体系（20 µL）：5×EasyScript®All-in-One SuperMix for qPCR 4 µL，基因组DNA 去除剂1 µL，总RNA 1 µL，无RNA 酶水补齐。反转录程序：25 ℃孵育10 min；42 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃，30 min。qPCR 体系（20 µL）：2×qPCR SuperMix 10 µL，正反向引物各1 µL（10 µmol/L），cDNA模板2µL，去离子水6µL。反应程序：94 ℃30 s；94 ℃5 s，60 ℃30 s，40个循环；qPCR引物序列见表1。GP73fl/fl及MKO小鼠各6个样本，扩增内参基因β-actin及目的基因GP73，每个样本设置3 个复孔，通过2-ΔΔCt法计算GP73mRNA的相对表达水平。

1.7 Western blot检测GP73蛋白表达水平

选取6～8 周龄GP73fl/fl和MKO 小鼠各3 只，解剖取出肝脏、肾脏及胸腺组织，分别称取50 mg 置于含NP40 裂解液的研磨管中，低温研磨至溶液澄清，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，吸取上清液备用。培养完成后的BMDMs 及PM 的培养基弃去，PBS 清洗3 次后加入适量NP40 裂解液，待细胞完全裂解后，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，吸取上清液备用。上述样品经BCA 法定量后加入SDS 上样缓冲液煮样，-80 ℃储存备用。

将上述蛋白样品行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒压电泳完成后，采用湿转法100 V 恒压转膜60 min；5%脱脂牛奶室温封闭2 h；分别置于1×TBST 稀释的GP73 多克隆抗体（1∶1 000）、β-tubulin 单克隆抗体（1∶10 000）中，4 ℃冰箱孵育过夜；1×TBST 清洗3次，每次10 min。加入1×TBST缓冲液稀释的辣根酶标记山羊抗兔IgG（1∶5 000），置于摇床室温孵育1 h；1×TBST 清洗3 次，每次10 min；最后配置ECL 化学发光液并显影保存。

1.8 小鼠组织器官生长发育评价

各取6 只GP73fl/fl小鼠及MKO 小鼠称重记录。解剖取出小鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、棕色脂肪、白色脂肪等主要组织器官，称重并计算组织与体重的比值。每组各抽取3只拍照保存。

1.9 小鼠血生化指标的检测

各取3 只GP73fl/fl及MKO 小鼠，经内眦静脉取血，静置1 h后，3 500 r/min 离心10 min，取上层血清备用。采用全自动生化分析仪，按操作说明，上机检测两组小鼠丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、血糖（glucose，Glu）、肌酐（creatinine，CRE）、尿素（urea，UREA）及尿酸（uric acid，UA）的水平。

1.10 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.4.0 软件分析数据，计量资料以均数±标准差（）表示，两组样本之间比较采用非配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠基因型鉴定

通过flox 引物仅扩增出408 bp 单条带的小鼠基因型为GP73flox/flox纯合子，仅扩增出356 bp 单条带的小鼠基因型为GP73+/+，同时扩增出356 bp 和408 bp双条带的小鼠基因型为GP73flox/+杂合子。通过Cre 引物扩增出700 bp 单条带的小鼠基因型为Lyz2-Cre+，未扩增出条带的小鼠基因型为Lyz2-Cre-。PCR 检测结果显示，7、10 号小鼠flox 两条带且Cre 无条带，为GP73flox/+小鼠；4 号小鼠flox 两条带且Cre 有条带，为GP73flox/+Lyz2-Cre+小鼠；5、8、12号小鼠flox单条带且Cre有条带，为GP73flox/floxLyz2-Cre+小鼠；6、9、11号小鼠flox单条带且Cre无条带，为GP73flox/floxLyz2-Cre-小鼠（图2）。

图2 小鼠基因型PCR鉴定结果Fig.2 Identification results of mouse genotype by PCR

2.2 巨噬细胞GP73基因敲除效果的验证

2.2.1 基因水平敲除效果鉴定 提取GP73fl/fl和MKO小鼠BMDMs、PM总RNA，利用qPCR检测其GP73mRNA水平，结果显示，MKO小鼠BMDMs、PM中GP73mRNA水平均较GP73fl/fl小鼠明显降低（P＜0.0001）（图3A）。

图3 巨噬细胞GP73基因敲除效果Fig.3 GP73 gene knockout efficiency in macrophages

2.2.2 蛋白水平敲除效果鉴定 利用Western blot 检测小鼠BMDMs、PM、肝脏、肾脏及胸腺中GP73蛋白的表达水平，结果显示，MKO小鼠BMDMs、PM中GP73蛋白表达水平均较GP73fl/fl小鼠显著降低，而在肝脏、肾脏及胸腺中，两组小鼠GP73蛋白表达水平差异无统计学意义（图3B）。表明GP73在巨噬细胞特异性敲除，巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠模型构建成功。

2.3 小鼠各组织器官生长发育情况

解剖12 周龄的GP73fl/fl及MKO 小鼠，取主要器官进行形态学观察和称量，结果显示，MKO 小鼠与GP73fl/fl小鼠相比，心、肝、脾、肺、肾、棕色脂肪及白色脂肪组织重量与体重之比差异无统计学意义（均P＞0.05）（图4A），各组织无显著形态学差异（图4B）。表明巨噬细胞条件性GP73基因敲除未影响小鼠各组织器官的发育。

图4 小鼠各组织/体重及形态学观察Fig.4 Tissue/body weight and morphological observation of mice

2.4 小鼠血生化指标的比较

提取GP73fl/fl及MKO 小鼠血清，血生化指标检测结果（表2）显示，MKO 小鼠与GP73fl/fl小鼠相比，各项血生化指标差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表2 小鼠血生化指标比较Tab.2 Comparison of blood biochemical indexes in the mice

3 讨论

目前Cre/LoxP 重组系统已广泛应用于条件性基因敲除小鼠的构建，基因敲除小鼠也是研究基因功能的重要模型［13］。为了研究巨噬细胞的功能，多种巨噬细胞基因敲除小鼠已被报道构建成功，例如Akt1flox/floxLyz2-Cre+、Atg5flox/floxLyz2-Cre+及Septin7flox/flox-Lyz2-Cre+小鼠等［14-16］。MÖLLERS等［17］发现在髓样干细胞向成熟巨噬细胞分化时，LysM的活性逐渐增强。ABRAM 等［18］研究表明，虽然LysM也在部分树突状细胞及粒细胞中表达，但是LysM-Cre+小鼠对成熟巨噬细胞的基因有着较高的敲除效率。因此，Lyz2-Cre+工具鼠常被用于巨噬细胞基因功能的研究。

越来越多的研究表明，GP73 在巨噬细胞中具有重要病理生理功能，且GP73 和巨噬细胞均与肿瘤的发生发展密切相关。近期研究发现，GP73 可通过影响NF-κB/NLRP3炎症小体信号传导，促进巨噬细胞的炎症反应［19］。GP73 作为先天免疫的负调节因子，还能通过与MAVS/TRAF6相互作用并促进MAVS/TRAF6降解，促进丙型肝炎病毒感染［20］；通过抑制先天性免疫反应和NF-κB信号通路促进乙型肝炎病毒复制［21］；乙型肝炎病毒通过激活GP73而抑制宿主的先天性免疫反应，从而促进肝细胞癌的发展［22］。有研究发现，胃癌中GP73 高表达会降低新辅助化疗的疗效，且GP73 为胃癌患者新辅助化疗预后的独立预测因素［23］；胆管癌患者术前GP73 血清水平升高时，其术后总生存率显著降低［24］。此外，研究表明，巨噬细胞参与构成肿瘤免疫微环境，其可通过促进肿瘤血管生成、诱导肿瘤免疫耐受等途径，导致肿瘤侵袭和转移［25-26］。然而，现有的研究尚未能完全揭示GP73 调控巨噬细胞功能的机制及对肿瘤性疾病进展的影响，亦无可靠的巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠模型可供科研选择。因此，构建该小鼠模型对研究GP73调控巨噬细胞功能在肿瘤性疾病中的作用和机制至关重要。

本研究应用Cre/LoxP 重组系统成功构建巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠，通过基因组和蛋白水平对其敲除效果进行验证，发现MKO 小鼠巨噬细胞GP73 表达水平显著降低，而肝脏、肾脏及胸腺组织中GP73 表达正常，说明MKO 小鼠特异性敲除了巨噬细胞的GP73基因，且其他组织的GP73 表达未受影响，但树突状细胞、粒细胞等髓系细胞中GP73 表达水平仍需进一步检测。此外，MKO 小鼠各组织的生长发育及血生化指标与对照小鼠无显著差异，说明MKO小鼠发育良好，未出现早期胚胎死亡、发育畸形等问题，且肝脏、肾脏等主要脏器的生长及功能未受到显著影响。因此，MKO 小鼠满足了作为研究GP73基因功能动物模型的基本条件。综上，该模型的成功建立，为深入研究GP73调控巨噬细胞功能在肿瘤性疾病中的作用和机制提供了良好的动物模型。