单中心CCLG-ALL 2018方案治疗MLL基因重排阳性儿童急性淋巴细胞白血病的临床研究

李晨 刘炜 王亚峰 王天有

作者单位：450000 郑州1郑州大学附属儿童医院，河南省儿童医院，郑州儿童医院血液肿瘤科；450000 郑州2郑州大学附属儿童医院，河南省小儿血液医学重点实验室；100045 北京3首都医科大学附属北京儿童医院血液肿瘤中心

急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是儿童最常见的恶性肿瘤，以幼稚淋巴细胞恶性克隆性增殖为特征［1］，约占儿童所有恶性肿瘤的25%，发病高峰年龄为2～5 岁。随着化疗方案的不断优化，目前儿童ALL 患者的存活率已超过85%［2］，但存在混合谱系白血病（mixed lineage leukemia，MLL）基因重排阳性急性淋巴细胞白血病（MLL-rearrangement acute lymphoblastic leukemia，MLL-r ALL）的患儿存活率仍较低。MLL基因位于染色体11q23 上，可与80多个不同的配对基因重排，其重排存在于初治和治疗相关的髓系和淋巴母细胞白血病中，约占儿童ALL 的5%、婴儿ALL 的75%［3］。据报道，MLL-r ALL以1 岁以下的婴儿最为多见，是最具侵袭性的白血病亚型之一，通常以起病快、高白细胞和预后不良为特征［4］。本研究回顾性分析郑州大学附属儿童医院于2018年4月至2022年7月收治的19例MLL-r ALL 患者的临床资料，以探讨儿童MLL-r ALL 患儿在中国儿童白血病协作组（CCLG-ALL 2018）方案治疗下的疗效。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2018年4月至2022年7月在郑州大学附属儿童医院按照CCLG-ALL 2018 方案诊治的19 例MLL-r ALL 患儿的临床资料。患儿的纳入标准：⑴临床诊断为MLL-r ALL（骨髓中原始+幼稚淋巴细胞≥20%且存在MLL基因重排）；⑵确诊前未接受过任何抗肿瘤治疗；⑶年龄小于18 岁；⑷采用CCLG-ALL 2018 方案治疗。排除标准：⑴中途转去其他医院治疗；⑵随访失联。回顾性分析所有患儿的性别、初诊时年龄、初诊白细胞、白血病细胞免疫分型、染色体核型等临床特征。本研究通过郑州大学附属儿童医院伦理委员会审核批准（伦理批文号：2023-K-130）。

1.2 实验方法

1.2.1 免疫表型分析 取患者骨髓2 mL，加入肝素抗凝后，加入红细胞裂解液裂解红细胞，然后加入表面标记的抗体，用PBS 洗涤后放置于流式细胞仪上进行上机处理（检测仪器为美国BD 公司FACS canto 型流式细胞仪），检测荧光阳性细胞的百分率，并以抗原表达超过20%为阳性。根据免疫表型特征可分为早期前B-ALL（Pro-B-ALL，CD19+CD10-cyµ-lgk-lgλ-）、普通型B-ALL（common-B-ALL，CD19+CD10+cyµ-lgk-lgλ-）、前B-ALL（Pre-B-ALL，CD19+CD10+/-cyµ+lgk-lgλ-）。

1.2.2 染色体核型分析 取患者骨髓5 mL，加入肝素抗凝后进行R 显带分析染色体核型。核型异常的依据《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN2013）》进行描述。

1.2.3 荧光原位杂交（FISH）技术检测MLL基因重排 取患者骨髓2 mL，加入肝素抗凝后，应用FISH技术，采用MLL基因断裂点双探针（红色和绿色荧光探针）标记靶细胞。在荧光显微镜下观察间期细胞的荧光杂交信号，每例至少分析200 个间期细胞。阴性细胞呈现两个黄色信号，阳性细胞呈现两红两绿四个荧光信号，或一红一绿一黄三个荧光信号。

1.2.4 RT-PCR 法检测MLL融合基因 取2 mL 骨髓，加入肝素抗凝，用Ficoll 梯度离心法分离骨髓标本中的单个核细胞。根据试剂使用说明，使用Trizol 试剂提取总RNA，用PCR方法检测常见MLL融合基因。

1.3 治疗方案与疗效评估

19 例MLL-r ALL 患儿参照CCLG-ALL 2018 诊治方案，根据诊断时的年龄、白细胞计数、免疫分型、细胞遗传学和分子生物学、早期治疗反应及微小残留病（minimal residual disease，MRD）水平等指标，均被划为高危组，均采用CCLG-ALL 2018（高危组）治疗方案，依次进行诱导缓解、早期强化、巩固、延迟强化和维持治疗。在化疗过程中监测泼尼松治疗反应、诱导化疗第15 天、第33 天及第12 周MRD 及MLL重排基因是否转阴来进行评估疗效。基因转阴是指通过RT-PCR 法检测融合基因定量＜1×10-4。完全缓解（complete remission，CR）定义为骨髓中原始及幼稚细胞比例＜5%，外周血无幼稚细胞，血红蛋白≥90 g/L，血小板计数≥100×109/L，中性粒细胞计数≥1.5×109/L。

1.4 随访

采用电话、短信、以及查阅电子病历方法进行随访，自患儿诱导缓解化疗期结束开始随访，随访间隔时间为2 个月，随访截至2023 年5 月31 日。随访期间，白血病达CR 后再次出现骨髓原始及幼稚细胞≥5%或者出现髓外浸润为复发。极早期复发：距离诊断时间＜18 个月出现疾病复发；早期复发：距离诊断时间在18～36 个月之间出现疾病复发；＞36 个月出现疾病复发为晚期复发。总生存期（overall survival，OS）指从疾病诊断至因任何原因死亡或随访截止的时间。无事件生存时间（event-free survival，EFS）是指从诊断到出现任何事件（包括疾病复发、疾病进展、疾病持续不缓解）的时间。

1.5 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，计量资料以中位数表示，计数资料以率（%）表示。采用Kaplan-Meier法进行生存曲线分析，采用Cox 比例模型分析影响预后因素，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征

19 例MLL-r ALL 患儿中男12（63.2%）例、女7（36.8%）例，男女比例为1.72∶1。年龄≤1 岁的为15（78.9%）例、年龄＞1 岁的为4（21.1%）例，诊断时的中位年龄为10.2个月（范围：0.5～156.0个月）。18（94.7%）例为B 前体急性淋巴细胞白血病（B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia，BCP-ALL），1（5.3%）例为急性T淋巴细胞白血病（acute T-lymphocytic leukemia，T-ALL）。初诊白细胞≥50×109/L的患儿为16（84.2%）例、初诊白细胞＜50×109/L的患儿为3（15.8%）例，初诊平均白细胞值为227.78×109/L（6.99×109/L～913.14×109/L）。初诊时骨髓平均原始细胞为81.2%（51.6%～97.0%），见表1。

表1 19例MLL-r ALL患儿的临床和血液学资料Tab.1 Clinical and hematological data of 19 children with MLL-r ALL

2.2 MLL-r ALL患儿的免疫表型分析

19 例MLL-r ALL 患儿标本的免疫表型分析结果显示，18 例MLL-r ALL 患儿为B 细胞系来源异常细胞，均有CD19、HLA-DR 和cCD79a 表达；1 例MLL-r ALL 患儿为T 细胞系来源异常细胞，可见CD2、CD3、CD5、CD7、CD13、CD38、CD99、cCD3、CD117表达。19例MLL-r ALL患儿中14例为Pro-B-ALL、2例为Common-BALL、2例为Pre-B-ALL。CD10+者4例，CD10-者15例。

2.3 MLL-r ALL患儿的染色体核型分析

19例MLL-r ALL患儿均进行染色体核型分析。R显带核型分析显示8例核型异常（异常率为42.1%）、6 例核型正常、5例因细胞生长不良未见可分析的分裂相。8 例核型异常的MLL-r ALL 患儿中有4 例涉及11q23的异常，分别为46，XY，add（4）（q21），add（11）（q23）［8］/46，XY［4］；46，XX，（4；11）（q21；q23）［5］/46，XX［5］；46，XX，t（4；11）（q21；q23）［4］/48，idem，+X，+21［5］/46，XX［1］；47，XY，+？9，del（11）（q23）［7］/46，XY［2］。

2.4 MLL-r ALL 患儿的MLL 基因重排及其融合基因分析

FISH技术检测结果显示，19例MLL-r ALL患儿均检测出MLL基因重排。RT-PCR法检测结果显示，19例MLL-r ALL 患儿中有17例检测出MLL融合基因，其中MLL-AF47例、MLL-AF1P1例、MLL-ENL4例、MLL-AF61例、MLL-AF91 例、MLL-AF102 例、MLL-CBL1 例，见表1。

2.5 MLL-r ALL患儿的治疗与疗效分析

19 例患儿中1 例在确诊后5 d 死亡，无有关疗效评价的数值，故将剩下18例患儿纳入疗效评价。18 例MLL-r ALL 患儿诱导治疗第15 天，5（27.8%）例患儿MRD＜1×10-3，13（72.2%）例患儿MRD≥10-3；基因转阴率为0%。诱导治疗第33 天，7（38.9%）例患儿MRD≥1×10-4，11（61.1%）例患儿MRD＜1×10-4；基因转阴率为66.7%（12/18）。治疗第12 周，16（88.9%）例患儿MRD＜1×10-4，2（11.1%）例患儿MRD≥1×10-4；基因转阴率为72.2%（13/18），诱导化疗第33 天完全缓解率为61.1%。

2.6 MLL-r ALL患儿的生存率及预后因素分析

中位随访时间为19.0个月（范围：0.1～62.0个月）。19例MLL-r ALL 患儿死亡9 例，死亡率为47.4%，其中死于治疗相关并发症3例，包括肺出血1例、重症感染2 例；1 例持续未缓解；死于复发5 例，复发率为26.3%，均为极早期骨髓复发，中位复发时间为6 个月（范围：5～9个月）。所有患儿的2年累积OS率、EFS率分别为57.9%和52.6%，见图1。单因素分析结果显示，诱导化疗第15 天MRD＜1×10-3组与≥1×10-3组、第33天MLL重排基因转阴与未转阴组、MLL-AF4组与非MLL-AF4组患儿的2 年OS 率比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），见表2、图2。而年龄、初诊白细胞、初诊血小板、初诊血红蛋白、初诊红细胞、初诊中性粒细胞、初诊LDH、CD10 表达情况、第33 天MRD、第12 周MRD 以及第12 周基因分组均未见明显统计学差异（均P＞0.05），见表2。将以上单因素分析P＜0.05 的因素纳入多因素分析，Cox模型多因素分析显示，重排基因MLL-AF4是影响MLL-r ALL 患儿OS 的独立预后不良因素（P=0.032），见表3。

图1 MLL-r ALL患儿的OS和EFS生存曲线Fig.1 Curves of OS and EFS of MLL-r ALL patients

图2 不同类型MLL-r ALL患儿的OS生存曲线Fig.2 The OS curves of different types of children with MLL-r ALL

表2 单因素分析影响MLL-r ALL患者OS的预后因素Tab.2 Univariable analysis of prognostic factors affecting OS in patients with MLL-r ALL

表3 多因素分析影响MLL-r ALL患者OS的预后因素Tab.3 Multivariable analysis of prognostic factors affecting OS in patients with MLL-r ALL

3 讨论

MLL基因又称KMT2A基因（组蛋白赖氨酸［K］-甲基转移酶2A 基因），位于11q23，其重排是导致急性白血病的常见原因［5］。MLL重排是染色体易位的结果，其重排产生MLL融合基因，进而编码具有新功能的蛋白产物，同时保留原有MLL 的一些功能。因此，得到的MLL 融合蛋白是一种独特的蛋白质复合体，在功能上与野生型MLL 复合体不同［6］。研究表明，MLL-r ALL 的患儿具有白细胞计数较高、年龄较小、对常规化疗效果较差、容易复发、死亡率较高的特点［7］。MLL基因重排的存在通常被认为是急性白血病预后不良的标志之一。本研究中MLL-r ALL 患儿年龄≤1岁者占78.9%、初诊白细胞≥50×109/L者占84.2%，符合发病年龄较小、初诊白细胞计数较高，与既往报道结果［7］相符。有研究表明，发病时的年龄和白细胞计数是影响MLL-r ALL 预后的因素［8］，而本研究显示初治时年龄≤1 岁、白细胞≥50×109/L 不是预后独立危险因素，可能与样本量及随访时间有限相关。本研究中MLL-r ALL 患儿的融合基因以MLLAF4为主，其他常见融合基因依次为MLL-ENL、MLL-AF10、MLL-AF9、MLL-AF6、MLL-AF1P、MLLCBL。 MEYER 等［5］的大样本量研究通过对876 名婴儿和671 名儿童进行MLL基因和相关融合基因的测定，也发现MLL融合基因以MLL-AF4最为多见，其余几种较为常见的融合基因依次为MLLAF9、MLL-ENL、MLL-AF10、MLL-AF6。

有研究表明，染色体核型分析法、FISH 法及RT-PCR 法3 种方法联合可以提高MLL基因重排检出率和明确融合基因类型［9］。本研究通过染色体核型分析法发现19 例患儿中只有14 例分析出染色体核型，5 例因细胞生长不良，未见可分析分裂相，表明该方法的敏感性较低；FISH 检测敏感性及特异性均较高，所有病例均能通过FISH 法检测出基因重排，然而该方法无法明确其融合基因类型，还需借助RT-PCR 确定伙伴基因类型。由此可见，联合以上三种方法可以提高MLL基因重排检出率并明确其融合基因类型，也为MLL-r ALL 患儿的诊断以及预后判断提供更多的依据。

前体B-ALL 根据细胞发育程度可分为Pro BALL、Common B-ALL、Pre B-ALL 共3 个阶段，且以Pro-B ALL 为主。本研究19 例MLL-r ALL 患儿中Pro-B ALL 患儿占73.7%，与既往报道基本相符［10］。既往研究表明，在MLL-r ALL 中，CD10 阴性是其不良预后的影响因素［11-12］，本研究中CD10 阴性与CD10 阳性组患儿的生存率虽然无显著差异，但是有不良预后趋势，有待后期扩大样本量及延长随访时间加以证实。

白血病的治疗包括化疗、造血干细胞移植、靶向治疗、放疗等，其中化疗是最主要的治疗方式。化疗方案依据风险度分层，分阶段进行，分为诱导缓解、早期强化、缓解后巩固、延迟强化及维持治疗［13］。目前主要采用CCLG-ALL 2018 高危方案治疗MLL-r ALL 患儿，并定期监测第15天、33天及12周骨髓MRD 及MLL重排基因是否转阴进行疗效评估。本研究结果显示，第15 天MRD＜1×10-3组与≥1×10-3组、第33 天MLL重排基因转阴与未转阴组、MLL-AF4组与非MLL-AF4组OS 比较差异均有统计学意义（P=0.032，0.042，0.008）。多因素分析结果显示重排基因MLL-AF4为影响MLL-r ALL患儿生存期的预后不良因素（P=0.032）。本研究虽然病例数较少，生存分析结果价值有限，但是仍可以看出重排基因为MLL-AF4是影响MLL-r ALL 患儿生存期的不良因素，后期可以采用大样本、多中心的临床研究来验证。

肿瘤化疗过程中可能会出现很多化疗相关并发症，本研究收集患儿诱导缓解阶段的不良反应类型，得出在诱导阶段最为常见的为血液系统不良反应（100%）。18 例患儿均需输血治疗，平均输血次数为12 次（3～56 次），输血次数与预后不存在统计学关系（P＞0.05）。其次为肺部感染（88.9%），腹泻、肝损伤、电解质紊乱、口腔感染及脓毒血症也较为常见，偶可见急性胰腺炎、败血症、甲状腺功能减退及消化道出血；9 例死亡患儿中2 例死于严重感染。因此说明在CCLG-ALL 2018 方案化疗下，患儿存在着较多不良反应，平衡化疗药物剂量与并发症防治之间的关系至关重要，有待于更进一步的研究。

MLL-r ALL患儿总体预后较差，缓解后容易复发，一方面是由于MLL-r ALL 患儿对化疗不敏感，短期疗效差，尽管用了CCLG-ALL 2018 高危组方案治疗，但第33 天完全缓解率仍较低，9 例死亡患儿中有4 例在化疗第33 天未达完全缓解。而导致化疗效果差的重要原因是细胞耐药，在治疗过程中白血病细胞容易对皮质类固醇和L-天冬氨酸耐药［14］。异基因造血干细胞移植（HSCT）是治疗急性白血病的方法之一，通常是耐药或者难治患者的唯一选择。然而，有研究发现HSCT 与单纯化疗相比并不能改善MLL-r ALL 儿童的EFS 或OS［15］。在TOMIZAWA等［16］的研究中发现HSCT 只对患有MLL基因重排且具有额外高危特征的婴儿亚群有益：年龄较小（＜6 个月）、白细胞计数高（≥300×109/L）或最初对皮质类固醇反应差的婴儿。MLL-r ALL 患儿预后差的另一重要原因是缓解后容易复发，一旦复发，治疗效果则远差于初诊ALL。该研究中9 例死亡患儿中5 例死于复发，且均为极早期骨髓复发，复发患儿最终全部死亡。因此针对MLL-r ALL 患儿较高的复发率，期望能尽早寻找一些新指标来更早、更准确的预测复发，从而避免高复发风险者的治疗不足和低复发风险者的过度治疗，以进一步提高儿童ALL的疗效。

目前研究发现嵌合抗原受体T 细胞（CAR-T）疗法是一种治疗MLL-r ALL 很有前景的方法，CAR-T疗法通过利用人体自身的免疫系统来靶向并摧毁癌细胞，属于一种免疫疗法［17］。2017 年FDA 批准了Tisagenlecleucel，这是第一种用于治疗复发和难治性B-ALL 的CAR-T 细胞疗法［18］。除此之外，靶向治疗也逐渐成为研究热点，最近研究发现一种小分子抑制剂VTP50469，它可以抑制Menin（MEN1）和MLL 的相互作用，进而诱导细胞凋亡。该药物在MLL-r ALL 患者来源的异种移植模型上显示出较好疗效，有赖于进一步应用于临床［19］。MLL重排导致与DOT1L、BRD4 和Menin 组装成独特的多蛋白复合体［20］。因此，使用DOT1L、溴域、薄荷素和bcl2 的抑制剂进行分子靶向治疗均具有较大的潜力。此外，选择性WD40重复结构域蛋白5（WDR5）降解剂MS67［21］、自噬抑制因子LAMP5 抑制剂［22］、Meis1 与PBX3 的结合抑制剂［23］等均有望用于治疗MLL-r ALL，以提高MLL-r ALL 患儿的总体生存率。

综上，CCLG-ALL 2018 方案治疗MLL-r ALL 患儿总体预后较差，患儿容易复发且复发时死亡率较高。重排基因MLL-AF4是影响MLL-r ALL 患儿应用CCLG-ALL 2018方案治疗效果的主要不良因素。