ω-氨甲基长叶烯的合成、表征及其抑菌活性

卢平平, 黄焰群, 甘月红, 黄兰杰, 葛 海, 黄道战*

(1.广西民族大学 化学化工学院;林产化学与工程国家民委重点实验室,广西 南宁 530008; 2.广西林产化学与工程重点实验室;广西林产化学与工程协同创新中心,广西 南宁 530008; 3.广西民族大学 材料与环境学院,广西 南宁 530105)

长叶烯是重质松节油的主要成分[1],具有独特的分子结构和松木似的木香香气,还对细菌[2-3]、真菌[4]、藻类[5-6]的生长有一定的抑制作用,在香料、医药、农药等行业有重要的应用及发展潜力。鉴于长叶烯易挥发、弱亲水性,人们利用Prins烯醛缩合、Vilsmeier-Haack 甲酰化等反应,在不改变长叶烯分子结构的基础上,通过构筑可增强亲水性和生物活性的官能团,合成含长叶烯分子结构、具有适宜亲水亲油性和较高生物活性的衍生物,如ω-氯甲基长叶烯[7]、长叶烯基季铵盐、N-取代苯并异噻唑[8]等,这已经成为研发长叶烯深加工新产品、拓展其新应用领域的有效途径之一。烯丙胺作为一种重要的生物活性功能基团[9],广泛存在于许多天然和合成药物分子中,例如辣椒碱、萘替芬、特比萘芬和布替萘芬等抗真菌药物[10-11]。为进一步拓展长叶烯的应用领域,本研究以前期合成的化合物ω-氯甲基长叶烯为原料,采用Gabriel伯胺合成法[12-13],进一步构筑烯丙胺功能基团,合成了含长叶烯结构的烯丙胺类化合物ω-氨甲基长叶烯,优化了ω-氨甲基长叶烯的合成工艺,表征了化合物的结构,并考察了化合物对几种常见致病性细菌和真菌的抑菌活性。

1 实 验

1.1 材料与仪器

长叶烯(1),广西梧松林化集团有限公司;ω-乙酰氧甲基长叶烯(2,GC纯度95%)和ω-氯甲基长叶烯(3,GC纯度95%),按参考文献[8,14]方法实验室自制。N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、邻苯二甲酰亚胺钾、石油醚、乙酸乙酯、无水乙醇、 80%水合肼、二甲亚砜(DMSO)、氢氧化钠和无水硫酸钠等,均为市售分析纯试剂。供试细菌4株,其中革兰氏阳性菌2株,为金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) ATCC-25923、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) ATCC-6633,以及革兰氏阴性菌2株,为大肠杆菌(Escherichiacoli) ATCC-8739、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae) ATCC-4352;供试真菌3株,分别为白色念珠菌(Candidaalbicans) ATCC-10231、热带念珠菌(Candidatropicalis) ATCC-13803、黑曲霉(Aspergillusniger) ATCC-16404,北京北纳创联生物技术研究所。

Magna-IR 550型傅里叶变换红外光谱(FT-IR)仪,美国Nicolet公司;XT-4型显微熔点仪,北京泰克仪器有限公司;Bruker AscendTM400 MHz核磁共振波谱(NMR)仪,瑞士Bruker公司;Xevo G2-S QTof型超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱(UPLC-Q-TOF-MS)仪、单晶X射线衍射(SC-XRD)仪,美国安捷伦科技公司;LabservK3型酶标仪,美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 ω-氨甲基长叶烯的合成

1.2.1中间体N-取代邻苯二甲酰亚胺衍生物(4)的制备 合成工艺路线如下图所示:

将化合物3(25.216 g, 0.1 mol)和邻苯二甲酰亚胺钾(18.522 g, 0.1 mol)加入到50 mL DMF中,在110 ℃下加热回流反应2 h。反应结束后,冷却到室温,加入50 mL水,抽滤,收集不溶性沉淀物。然后用石油醚洗涤3次,每次20 mL,除去未反应的化合物3,采用减压过滤收集不溶性沉淀,置于50 ℃下真空干燥3 h得白色粉状粗产品。将粗产品以乙酸乙酯为溶剂重结晶提纯2次,得白色晶体粉末产品,即N-取代邻苯二甲酰亚胺衍生物(4),化学名为(E)-2-(2-(4,8,8-三甲基十氢-1,4-甲薁-9-亚基)乙基)异吲哚啉-1,3-二酮。以无水乙醇为溶剂,溶剂缓慢挥发法培养得到无色块状单晶,进行SC-XRD晶体结构分析。

1.2.2ω-氨甲基长叶烯(5)的制备 在50 mL圆底烧瓶中加入化合物4(2.181 g, 6 mmol)、 80%水合肼(8.635 g, 138 mmol),滴加10%氢氧化钠水溶液(5 g),在120 ℃下加热回流反应6 h。反应结束后,待反应混合物冷却至室温,用石油醚萃取3次,每次10 mL。将油相合并,用水洗涤3次,每次10 mL,加入无水硫酸钠干燥过夜,过滤,减压旋转蒸发回收溶剂,50 ℃真空干燥得到黄色油状产物,即得到化合物5。

1.3 分析与表征

1.4 抑菌活性测试

采用96孔板微量肉汤稀释法[15-16]测定化合物的最小抑菌质量浓度(MIC)。首先,分别将细菌和真菌的菌种在水解酪蛋白琼脂(MHA)和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)的平板中培养24 h。之后挑选单菌落分别放置于灭菌水中制成麦氏浊度0.5的菌悬液,再用水解酪蛋白肉汤(MHB)和马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)稀释制备成用于检测抑菌活性的含菌1×105CFU/mL的菌悬液;并用含有2% DMSO的MHB和PDB培养基,配置成质量浓度为1 000 mg/L的待稀释的样品溶液。

采用二倍稀释法,用无菌移液枪向无菌96孔板的1号孔和2号孔加注100 μL样品溶液,2～12号孔加注100 μL无菌MHB或PDB培养基,再从2号孔中取出混匀的100 μL样品溶液于3号孔中,同法依次稀释配制供试样品溶液。然后,向所有供试样品溶液加注100 μL含菌为1×105CFU/mL的菌悬液,最终供试样品溶液的质量浓度依次为500、 250、 125、 62.5、 31.25、 15.62、 7.81、 3.91、 1.95、 0.98、 0.49和0.24 mg/L。每种质量浓度供试样品溶液均平行重复3次,每块96孔板做1组阳性对照和空白对照,其中利福平、酮康唑分别作为细菌、真菌阳性对照品,不含供试化合物的样品溶液作为空白对照。最后将含细菌的96孔板置于37 ℃培养箱培养24 h,含真菌的96孔板置于30 ℃培养箱中培养24 h,取出用酶标仪于630 nm波长下测出每孔的光密度(OD)值,按下式计算抑制率:

I=(A2-A1)/A2×100%

式中:I—待测样品对细菌或真菌生长的抑制率,%;A2—空白对照组OD值;A1—实验组OD值。

2 结果与讨论

2.1 合成工艺的选择

2.1.1化合物4的合成 N-取代邻苯二甲酰亚胺衍生物是Gabriel伯胺合成中间体,可由卤代烃和邻苯二甲酰亚胺钾制备。在分子结构上,化合物3可看作是含长叶烯结构的烯丙基氯,化学活性高,理论上容易与邻苯二甲酰亚胺钾发生取代反应,生成化合物4。然而,化合物3不溶于水,难以直接与亲水性的邻苯二甲酰亚胺钾在水、乙醇、丙酮等常规溶剂体系中进行充分反应。实验发现,以非质子极性的DMF为溶剂,取代反应能顺利进行,其中化合物3、邻苯二甲酰亚胺钾和目标产物4均可在DMF中溶解或分散,而副产物KCl不溶于DMF、以沉淀形式析出;提高反应温度、增加搅拌速度,可减缓或消除不溶性沉淀KCl对反应的影响,从而加速取代反应的进行,尤以加热回流搅拌条件最优。另外,反应结束后,利用未反应原料、目标产物、副产物和DMF在不同溶剂中溶解度的差异,分别以水、非极性溶剂石油醚为溶剂除去未反应原料及副产物KCl,化合物4不溶于水和石油醚,通过减压过滤收集,再以无水乙醇重结晶提纯。

2.1.2水解反应工艺的选择 N-取代邻苯二甲酰亚胺衍生物的水解反应是Gabriel伯胺合成的重要步骤,水解反应方法分为酸解、碱解和肼解。实验发现,在酸性或碱性溶液中,中间化合物4的水解反应较困难,产率低于50%,产物分离工序复杂;而在水合肼甲醇或乙醇溶液中水解反应能顺利进行,产率高于酸解或碱解,但产率仍低于75%。究其原因,可能是化合物4的空间位阻较大,不利于H+或OH-的进攻,而且副产物邻苯二甲酰肼中2个羰基对N原子均存在吸电子的-C效应,使N上电子云密度大大降低,与N原子相连的H原子表现出微弱酸性,可与产物伯胺结合为盐类复合物[17-18]。另外,溶剂甲醇或乙醇的存在,加热回流反应体系的温度通常低于90 ℃,肼解反应受限、效率低。

为此,本研究尝试采用无溶剂肼解反应体系,以提高回流反应温度,通过加入少量NaOH溶液,使反应平衡向产物方向移动,从而强化肼解反应效率。因此在1.2.2节的反应条件下,不添加NaOH时,化合物5的产率为70.2%,而添加5 g 10% NaOH溶液后,化合物5的产率可达94.1%。结果表明:化合物5的产率明显提高,在反应结束混合物冷却后,能直接以石油醚为溶剂,通过萃取分离得到纯度高达98%(GC纯度)的产品。

2.2 不同条件对水解反应的影响

2.2.1反应温度 在与1.2.2节相同的反应物料比、NaOH溶液用量、反应时间条件下,考察反应温度对化合物5产率的影响,结果见图1(a)。由图可知,随着温度的升高,产率呈先增加后降低的趋势。其原因可能是反应温度低于120 ℃ 时,反应物未能充分活化,反应较缓慢且反应不完全,产率较低;温度升至120 ℃,刚好为水合肼的沸点,反应体系处于平稳的回流加热状态,反应混合物中水合肼的浓度变化不大,反应速度快,产率较高;温度高于120 ℃ 时,水合肼的蒸发量增加,反应混合物中水合肼浓度降低,反应速度减慢,产率降低。因此,适宜的反应温度为120 ℃,在此温度下化合物5产率为94.1%。

a.反应温度temperature; b.反应时间time; c.n(水合肼)∶n(化合物4) n(hydrazine hydrate)∶n(compound 4)图1 反应工艺条件对化合物5产率的影响Fig.1 The effect of reaction conditions on the yield of compound 5

2.2.2反应时间 在反应温度120 ℃、反应物料投加量与1.2.2节相同的条件下,考察反应时间对化合物5产率的影响,结果见图1(b)。由图可知,反应时间对产率有较大的影响。反应时间低于6 h时,原料反应不完全,产率较低;反应时间高于6 h时,产率随着时间的延长而逐渐降低,反应时间越长,加剧了副反应发生。因此,反应时间选择6 h为宜,此时化合物5的产率为94.1%。

2.2.3反应物料比 在化合物4投加量2.181 g(6 mmol)、 10%NaOH溶液5 g、反应温度120 ℃和反应时间6 h的条件下,考察了反应物料比n(水合肼)∶n(化合物4)对化合物5产率的影响,结果见图1(c)。由图可知,当水合肼用量较少(低于60 mmol)时,反应结束冷却后,反应混合物凝结为固体,产物较难分离,产率较低;随着水合肼用量的增加,产率逐渐提高,当水合肼的用量增加至120、 138 mmol时,产率分别达到92.6%、 94.1%,继续增加水合肼的用量,产率缓慢增加但变化不大,如当水合肼用量为180 mmol时,产率提高至96.2%。综合考虑,较佳的反应物料比n(水合肼)∶n(化合物4)为23∶1,此时化合物5的产率为94.1%,纯度为99.98%。

2.3 化合物结构表征

2.3.1化合物4

2.3.1.2晶体结构解析 采用SC-XRD测定化合物4的晶体结构,分子晶体结构和晶胞堆积图如图2所示。

图2 化合物4的分子晶体结构(a)和堆积透视图(b)Fig.2 The molecular crystal structure(a) and stacking perspective(b) of compound 4

化合物4晶体(CCDC 2205004) 呈单斜晶系,C2空间群;晶胞参数为a=1.577 5(1) nm,b=0.752 74(9) nm,c=3.344 0(2) nm,α=90°,β=92.834(7)°,γ=90°,V=3.966 0(6) nm3,Mr=363.48,Dc=1.217 mg/m3,Z=8,μ=0.076 mm-1,F(000)=1 568。可以看出,化合物4晶体为双分子结构,即每个不对称单元有2个晶体学上独立的分子,每个分子含有1个邻苯二酰亚胺结构和1个ω-甲基长叶烯结构,这2个结构通过N(1)原子和C(9)原子或N(1A)和C(9A)原子连接。N(1)—C(9)的键长为0.146 9(5) nm,N(1A)—C(9A)的键长为0.146 3(4) nm,其它主要键长和键角见表1和表2。

表1 化合物4中主要键的键长Table 1 The bond lengths of the main bonds in compound 4

表2 化合物4中主要键的键角Table 2 The bond angles of the main bonds in compound 4

从晶胞堆积图(图2(b))可以看出,化合物4分子间存在4种错位面对面堆积方式的π-π相互作用[19-20],分别为Cg(4)…Cg(11)(橙色细虚线)、Cg(1)…Cg(14)(石灰绿色细虚线)、Cg(14)…Cg(4)(天蓝色细虚线)和Cg(4)…Cg(14)(粉色细虚线),π-π堆积的参数列于表3。前2种存在于苯环与吡咯环之间,对于Cg(4)…Cg(11),质心距离为0.351 3(3) nm,二面角为0.3(3)°,最短垂直距离为0.341 3(2) nm;对于Cg(1)…Cg(14),质心距离为0.353 0(3) nm,二面角为1.6(3)°,最短垂直距离为0.341 7(2) nm。后2种存在于苯环与苯环之间,它们的二面角均为0.8(3)°,但质心距离不同;对于Cg(14)…Cg(4),其质心距离为0.371 8(3) nm,最短的垂直距离为0.341 5(2) nm;而对于Cg(4)… Cg(14),其质心距离为0.395 4(3) nm,最短垂直距离为0.347 0(2) nm。

表3 晶体的π-π相互作用Table 3 The π-π interactions of the crystal

化合物5是化合物4的肼解反应产物,反应前后分子构型保持不变,其分子结构可从化合物4的分子晶体结构推断,绝对构型如图3所示,按IUPAC命名法,其化学名称为(E)-2-(4,8,8-三甲基十氢-1,4-甲薁-9-亚基)乙基-1-胺。

图3 化合物5的绝对构型Fig.3 The absolute configuration of compound 5

2.4 抑菌活性分析

化合物1～5的抑菌活性测定结果见表4。

由表4可知,化合物5能抑制细菌和真菌的生长,表现出较高的抑菌活性,其对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、白色念珠菌、热带念珠菌和黑曲霉的MIC值分别为1.95、 1.95、 7.81、 3.91、 3.91、 1.95和15.63 mg/L。化合物5对所有测试细菌和真菌的抑菌活性明显高于长叶烯(1)和化合物2～4,说明长叶烯结构和烯丙胺功能基团具有协同增强抑菌作用,伯胺官能团的引入使化合物5具有亲水亲油性,表现出较高的抑菌活性。与阳性对照品相比,化合物5对细菌的MIC值等于或高于利福平,即抑菌活性稍弱于利福平,而对2种真菌白色念珠菌和热带念珠菌的MIC值低于酮康唑,即抑菌活性高于酮康唑,其中原因尚不清楚。化合物5具有化学活性的伯胺功能基团,本课题组后续拟继续开展化合物5衍生物的合成及生物活性研究,进一步揭示其原理及作用机制。

3 结 论

3.1采用改进的Gabriel伯胺合成法,由ω-氯甲基长叶烯(3)经中间化合物4进一步合成了ω-氨甲基长叶烯(5),产物分子结构经FT-IR、1H NMR、13C NMR、HRMS和SC-XRD进行表征确认。单因素试验结果表明:采用无溶剂回流加热水合肼水解反应工艺,添加少量NaOH溶液,能促进水解反应的进行,在简化产物分离纯化工艺的同时提高产率。较佳的水解反应工艺条件为:n(水合肼)∶n(化合物4)为23∶1、 10%氢氧化钠溶液5 g、反应温度120 ℃、反应时间6 h,此条件下化合物5的产率高达94.1%,纯度为99.98%。

3.2抑菌活性实验结果表明:化合物5对2种革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)、 2种革兰氏阴性菌(大肠杆菌、肺炎克雷伯菌)和3种真菌(白色念珠菌、热带念珠菌、黑曲霉)的生长均具有明显的抑制作用,其MIC值分别为1.95、 1.95、 7.81、 3.91、 3.91、 1.95和15.63 mg/L,其对2种真菌白色念珠菌和热带念珠菌的抑制活性高于阳性对照品酮康唑。化合物5具有化学活性和抑菌活性的烯丙胺功能基团,有望通过进一步衍生化合成系列衍生物,提高抑菌等生物活性,进一步拓展长叶烯的应用领域。