秦岭地区高等植物叶片游离氨基酸碳稳定同位素分析

孙乐水, 朱震宇,2*, 王 颖, 赵 雨, 闫秋林

(1.陕西科技大学 化学与化工学院 天然产物稳定同位素组学实验室, 陕西 西安 710021; 2.陕西科技大学 陕西省轻化工助剂重点实验室, 陕西 西安 710021)

0 引言

植物碳稳定同位素值记录了植物生长过程中的环境信息,能够揭示植物对纬度、海拔、温度、降水等环境因子变化的响应[1,2],因此,碳稳定同位素被广泛用于讨论各种生态环境中物质来源和迁移规律[3].随着CO2浓度升高引起自然环境及气候变化,碳稳定同位素在植物对气候环境变化之间反馈调节的应用成为地球化学的研究热点[4].

植物在生态系统与大气CO2的交换中起着重要作用,叶片是植物与周边环境发生气体交换的主要器官.不同光合类型的植物(C3、C4、CAM)叶片δ13C值大小关系为:C4>CAM>C3[5-7].C3、C4、CAM等植物δ13C值在表观差异上,是植物对环境因子需求的不同,对气候环境变化有着不同的响应,内在原因是这三类植物在光合作用过程中固碳方式存在差异,具有不同的碳同位素分馏机制,因而碳同位素组成存在显著差异.影响植物体内特定物质碳稳定同位素和总碳稳定同位素变化有多种因素,例如温度差异、降水量不同、陆地/水生植物的变化、有机质含量的高低和当地水文环境差异等[8].因此对植物碳稳定同位素的研究可以揭示温度、降水等气候环境对植物生理过程的影响,如降水减少和温度增加会使植物减少蒸腾作用,提高自身水分利用效率[9].同时,现代植物的稳定同位素研究成果可为古环境重建和恢复一定历史时期内特定地区植被、温度、降水、季风等气候环境变化提供依据.

氨基酸作为构成生命的基本单元之一,是联系植物与周围环境的重要物质.植物组织中游离氨基酸能直接或是间接对环境中生物或是非生物的压力做出响应[10].李红燕[11]在调查无定河流域的植被、沉积物与土壤中氨基酸的碳、氮稳定同位素基础上,探讨了河水中的植物营养物质来源,并应用到黄东海生态食物链研究中;Farooq M等[12]和Hakeem K R等[13]研究了植物中游离氨基酸对干旱这一环境压力的响应,干旱使得植物蒸腾速率、光合速率、气孔导度下降,叶绿素色素含量和光合作用强度降低,并且可以降低植物各器官对无机盐营养物质的吸收,使得植物叶片内氨基酸δ13C增大.Bowman等[14]在综述盐分对植物δ13C的影响中,认为无论是盐生植物还是非盐生植物,植物氨基酸δ13C随盐度的增加而增大.此外还有研究者继续探讨了重金属[15]、营养不平衡[16]、寒冷[17,18]和季节性变化[19,20]等环境胁迫因素对植物中游离氨基酸δ13C的影响.

汇总前人的研究工作会发现目前对于植物内总氨基酸碳稳定同位素对周边环境因素的响应研究已较为成熟,如光照时间变长,光反应强度增强,叶片气孔导度增大,使得植物叶片内总氨基酸δ13C减小[21].若想探究植物生理过程并进一步得到更加精细准确的环境信息,需要继续细分到单个氨基酸碳稳定同位素值层面,某个或某组氨基酸对上述环境因子的响应是否与总氨基酸有相同的趋势以及不同的氨基酸碳稳定同位素比值之间是否存在某种联系,目前有关植物体内单个氨基酸碳稳定同位素值对环境的响应情况研究较少.本文将以秦岭地区的植物叶片为研究对象,探究了植物叶片内单个氨基酸碳稳定同位素比值的内在规律.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

1.1.1 实验试剂

11种氨基酸(丙氨酸Ala、缬氨酸Val、异亮氨酸Ile、亮氨酸Leu、脯氨酸Pro、天冬氨酸Asp、苏氨酸Thr、酪氨酸Tyr、赖氨酸Lys、谷氨酸Glu、苯丙氨酸Phe),美国西格玛奥德里奇公司;乙醇、甲醇、二氯甲烷均为色谱纯,Adamas-beta;氨水、无水硫酸钠均为分析纯,天津大茂化学试剂厂;盐酸、氢氧化钠均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司;三氟乙酸,分析纯,上海麦克林生化科技有限公司;吡啶,色谱纯,CNW;氯甲酸甲酯,分析纯,艾科试剂;陶氏Dowex强阳离子树脂(50WX8),色谱纯,ACROS.

1.1.2 实验仪器

冷冻干燥机,Alpha 2-4 LD plus,CHRIST;超声仪,昆山市超声仪器有限公司;真空线路;真空干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司;层析柱,欣维尔玻璃仪器有限公司;旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂;全自动研磨仪,上海净信实业发展有限公司;离心机,3-30KS,西格玛奥德里奇公司;超声仪,KQ5200DE,昆山市超声仪器有限公司;超纯水制造系统,西安优普仪器设备有限公司;Trace 1300/ISQ气质联用仪,ThermoFisher Scientific;同位素比质谱仪,MAT 253 Plus IRMS,ThermoFisher Scientific.

1.2 样品的采集和处理

1.2.1 样品采集信息

植物叶片样品于2021年08月采集,采样点位于秦岭山脉中段南坡宁陕县境内的火地塘林区(33°18′～33°28′ N,109°20′～109°29′ E)及北坡周至县楼观台地区(34°15′～34°19′ N,108°21′～109°25′ E).南坡采集的植物样品有桑树、高山榕、琴叶榕、栗树、胡桃、卫矛、构树、千金榆、槲栎、马尾松、君迁子、麻栎十二种木本植物及草本植物紫苏;北坡采集的植物样品有桑树、高山榕、琴叶榕三种木本植物.在样品运输过程中以无菌塑封袋包装并存放于干冰中冷藏保存.

1.2.2 样品的处理

样品采集完带回实验室处理,对所有样品叶片进行分离,只保留正常生长形态的叶片,并对叶片表面清洗干净以除去样品表面吸附的颗粒物和尘土,洗净的叶片放入75 ℃烘箱中持续烘干24 h后,将样品放入球磨机中研磨成粉,保存备用.

1.3 氨基酸的提取和纯化

1.3.1 陶氏 DOWEX 强阳离子树脂(50WX8)活化

取100 g阳离子交换树脂于超纯水中浸泡一晚.取40 mL浸泡完成的阳离子交换树脂加入到玻璃层析柱,湿法装柱,用250 mL 2 mol/L的氢氧化钠水溶液慢速淋洗阳离子交换树脂,后加入超纯水淋洗至中性;使用250 mL 2 mol/L的盐酸水溶液慢速淋洗阳离子交换树脂,再次加入超纯水淋洗至中性.至此阳离子交换树脂活化完成.

1.3.2 游离氨基酸提取方法

取2 g植物样品粉末于50 mL离心管中,加入20 mL超纯水混匀,室温下超声15 min.超声结束,放入离心机进行离心操作,11 000 r/min,30 min,取上清液;残渣用20 mL超纯水复提,将两次提取的上清液混合均匀,加入等体积20%三氟乙酸沉淀蛋白1 h,随后离心,11 000 r/min,30 min,取上清液.

1.3.3 氨基酸提取液的纯化

(1)将上述除去蛋白的氨基酸粗提取液pH调节至1～2,再缓慢加入层析柱.待氨基酸粗提液流经树脂后,静置20 min,以便提取液与阳离子交换树脂充分吸附.

(2)接着用50 mL的超纯水进行淋洗树脂,以除去吸附在阳离子交换树脂中的杂质,再加入500 mL 4 mol/L氨水进行洗脱,收集洗脱液.

1.4 氨基酸衍生化(N-酰化)

本实验采用氯甲酸甲酯(MCF)作为衍生试剂,该衍生方法具有快速、简便、常温下即可进行、衍生生成物质稳定等优点.氯甲酸甲酯作为衍生试剂的反应原理:在甲醇和吡啶存在的条件下使用氯甲酸甲酯对氨基酸进行衍生机理如图1所示.

图1 MCF衍生氨基酸反应方程式[22]

将1.3.3中收集的洗脱液,旋转蒸发.使用1～2 mL 1 mol/L HCl溶解并转移至5 mL小瓶,将其封口并冷冻保存,备用.具体衍生步骤如下:

(1)移取备用样品溶液200 μL,滴加2～3滴饱和NaOH,使体系pH>10,随后加入无水甲醇(100 μL)和吡啶(50 μL),涡旋10 s.

(2)加入衍生试剂氯甲酸甲酯(30 μL)后涡旋10 s,然后混合物静置10 min.

(3)加入三氯甲烷(300 μL)和去离子水(200 μL)之后涡旋10 s,等待体系分离,然后将三氯甲烷层移至干净的GC小瓶内.

(4)重复步骤(3)三次,收集三氯甲烷有机相.

(5)往收集到的有机相中加入足量无水Na2SO4,静置10 min.将干燥后的样品移入干净的小瓶中,使用氮气仪吹干后,加入适量二氯甲烷溶解,进行GC-MS分析.

1.5 标准氨基酸的配制

对Ala、Glu、Pro、Asp、Lys、Thr、Leu、Ile、Val、Phe、Tyr这十一种能够定量的游离氨基酸进行分析,分别配制浓度梯度(0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL、2.0 mg/mL、3.2 mg/mL、4.0 mg/mL).

1.6 氨基酸的测定方法

(1)色谱质谱条件:HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm, Agilent Technologies);进样口温度280 ℃;程序升温:初始温度80 ℃保持2 min,第一升温梯度,以10 ℃/min的速率升温至120 ℃保持3 min,第二升温梯度,以5 ℃/min的速率升温至170 ℃保持2 min,第三升温梯度,以10 ℃/min的速率升温至250 ℃保持2 min;进样量:1 μL;载气:He;载气流量:1.2 mL/min;分馏进样,分流比10.0,分流流速12.0 ml/min.

(2)EI离子源:离子源温度280 ℃;传输线温度280 ℃;电子能量,70 eV;发射电流,50 μA;电子倍增电压,1 818.8 V;选取全扫描方式(full scan);质量范围为50～500 amu.

2 结果与讨论

谷氨酸族氨基酸和天冬氨酸族氨基酸作为植物生长过程中的最重要的两类氨基酸,两者之间的代谢互相协调,互相转化,所参与的生化过程在植物生长体系中较为复杂,而支链族氨基酸和芳香族氨基酸均是单向合成,合成过程没有其他氨基酸干扰.故本研究目标只对支链族氨基酸和芳香族氨基酸进行讨论分析.

2.1 相同地区下不同植物叶片各氨基酸碳稳定同位素分析

结合图2可以直观地看出,十种植物样品叶片内支链族氨基酸(Val、Leu、Ile)和芳香族氨基酸(Phe和Tyr)中各氨基酸δ13C值关系.

图2 秦岭南坡十种植物样品叶片中单个氨基酸δ13C值比较

2.1.1 支链族氨基酸

由图2、表1可知,在植物正常生长情况下,植物叶片中Ile的含量低于Val和Leu,δ13CIle值相对偏正.对于支链族氨基酸碳稳定同位素比值差异原因分析如下:

表1 秦岭南坡地区植物样品叶片氨基酸含量

(1)生物代谢过程的碳同位素分馏.植物的碳源多为空气中的CO2气体,空气中CO2的碳同位素比值在同一地区各个季节一般无较大差异[23].植物的光合作用分为两个阶段:第一阶段,大气CO2经叶片气孔进入叶绿体进行扩散过程,植物优先吸收12C,导致植物内部相对于外界大气亏损13C,从而产生4.4‰的扩散分馏[24];第二阶段卡尔文循环,卡尔文循环的主要目的是碳固定,在第一步的羧化反应中,Rubisco羧化酶进行羧化作用时会产生-31‰～-22‰的分馏[25],磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEP等辅助酶会产生同位素效应,但相对较小,约-5.7‰～-0.5‰[26].葡萄糖作为光合作用产物之一,经糖酵解过程,最终生成丙酮酸.此过程从富含13C 葡萄糖的C-3和C-4转化为13C贫化C-1的丙酮酸,丙酮酸的δ13C值远小于葡萄糖的C-3和C-4[27].柠檬酸循环(TCA循环)中羧化酶的活性作用降低了固碳相关的分馏约2‰[28].

故在植物叶片内的生化反应中,由于同位素分馏的影响,各个生化过程的重要产物,如卡尔文循环中产生的葡萄糖、糖酵解的最终产物丙酮酸、TCA循环中产生的草酰乙酸,其δ13C值均会不同程度地偏负(丙酮酸受到的影响最大),进而可以影响到单个氨基酸δ13C值.

(2)氨基酸合成路径.如图3(a)、(b)所示,图3(a)虚线框内是丙酮酸,图3(b)虚线框内是2-氧代丁酸,因反应物碳原子数不同生成的产物侧链碳原子数才不相同.结合三种氨基酸合成代谢路径可以发现,Val和Ile分享了几乎相同的代谢过程,由酶参与反应的作用或产生的影响理论上应是相同的[29].Ile的6个碳原子有4个来自于Asp(受草酰乙酸影响),只有两个来自丙酮酸,Val与Leu合成的唯一原料为两分子的丙酮酸,Val和Leu更易受到丙酮酸的影响,且Leu的合成过程更长.在合成过程中,反应会优先利用12C,反应路线越长,理论上产物δ13C值会更偏负.

图3 三种支链族氨基酸的合成代谢路径及其相互关联

由于卡尔文循环过程与糖酵解过程产生的分馏效应影响比TCA循环要大得多,进而影响δ13C丙酮酸值比δ13C草酰乙酸值更偏负,且在合成过程中,反应会倾向于选用12C,使得对应生成的氨基酸δ13C值更偏负.综合两个因素推测δ13CIle在三者中相对富集,δ13CVal相对于δ13CLeu富集.结合图2可以发现:(1)δ13CIle值在三者中相对富集,推测可能是和不同植物的叶片气孔导度大小不同有关,当叶片气孔导度减小时,植物内部CO2浓度降低,减少了TCA循环及涉及的各种代谢网络[30],合成Ile过程的碳稳定同位素分馏效应有减弱的趋势,使得δ13CIle相对偏正的程度更大;(2)δ13CVal与δ13CLeu值十分接近,推测因合成路线长短而产生的分馏效应对δ13CAAS影响很小.由于Val和Leu代谢途径的差异,不同植物对环境的响应也不尽相同,两种转氨酶(酶d,缬氨酸转氨酶;酶h,亮氨酸转氨酶)的同位素分馏作用有较大的差别[31],故δ13CVal与δ13CLeu值有不同程度的差异也是合理的.

2.1.2 芳香族氨基酸

植物体内,Phe和Tyr主要是通过莽草酸途径合成,且Phe是植物体内一系列次级代谢产物的前体化合物,如木质素化合物、酚类化合物及萜类化合物等.此外,Tyr的合成也有Phe的参与,可以由Phe羟基化生成.在植物正常生长情况下,植物叶片内Phe合成含量较多.适宜环境下植物生长速度快,细胞会争夺利用CO2,如果CO2供给不足,碳同位素分馏就减小.

在植物生长发育中,Phe主要在PAL(苯丙氨酸裂解酶)作用下重新生成苯丙酮酸,PAL与TAL(酪氨酸解氨酶)基因在不同的生物中表达不同,如在杨树正在发育的木质部、嫩茎和嫩叶中PAL活性最高[32],TAL在草本植物和微生物中活性高[33].在相同植物的不同部位上PAL基因的表达也不同,Barros J等[33]在禾本科植物研究中发现,茎中大约50%的木质素是由L-Tyr而不是L-Phe合成的,而叶片中PAL的活性远远大于TAL,叶片中的木质素主要由苯丙氨酸合成.PAL催化作用是Phe代谢的一个分支点并且伴随着明显的同位素分馏作用,其δ13C值相对偏负.所以在同一植物正常生长情况下,叶片中δ13CPhe值相对偏负,δ13CTyr值相对偏正.

2.2 不同地区相同植物叶片各氨基酸碳稳定同位素分析

取三种在秦岭南北两个地区采集的样品(桑树、琴叶榕、高山榕),各叶片单个氨基酸含量见表2所示,单个氨基酸碳稳定同位素数据如图4所示.可以发现,不同地区下相同样品叶片中各氨基酸含量与其碳稳定同位素值存在明显差异,秦岭北部地区样品叶片的氨基酸(除Phe外)含量与南部地区样品相比较多,北部地区样品叶片各氨基酸(除Tyr外)δ13C值相对偏正.

表2 秦岭不同地区相同植物叶片单个氨基酸含量

图4 秦岭不同地区相同植物叶片单个氨基酸δ13C值

根据研究地点及采样品种的具体情况可分析,生态环境和气候变化可能是导致氨基酸δ13C值升降的主要因素.秦岭地区南北差异较大,其南坡温度较高,山地立体气候的自然带类型较多;其北坡的温度较低,各自然带的类型较少.南坡的降水量普遍在1 000 mm以上,局部地方在2 000 mm以上;北坡的降水量则明显减少,大多数地方都在1 000 mm以下,部分地方仅有500 mm左右,同位素热力学分馏与温度有关,所以在一定的条件下,较高的δ13C值可能反映环境温度较低,而较低的δ13C值可能反映环境温度则较高[34].

秦岭北部地区环境相对恶劣,胁迫处理能显著性地改变叶片的氨基酸代谢并降低叶片中的有机氮含量和总氮含量,进而影响到植物体内各氨基酸的合成.在胁迫处理下,大部分氨基酸含量都增多,Phe含量减少,这可能表明在植物组织中苯丙酮酸途径具有明显的抵御逆境胁迫的生理作用[35].胁迫处理下,苯丙酮酸代谢途径受到抑制,Phe转换率大大降低,植物生长缓慢,13C累积,δ13CPhe值相对偏正;相比于δ13CPhe,δ13CTyr明显贫化,与正常生长情况下相反.这种相反的响应趋势表明叶片中芳香族氨基酸以不同的碳代谢方式来应对环境胁迫.与2.1内容相联系,会发现支链族氨基酸碳稳定同位素值大小关系几乎不受地区差异的影响,可以通过对δ13CPhe值与δ13CTyr值大小的比较来初步预测秦岭地区所采样品产地溯源等问题.

3 结论

本文选取了秦岭南北地区部分植株为研究对象,分为不同地区相同植株和相同地区不同植株两组,进行植物叶片游离氨基酸的提取并测定各氨基酸δ13C值,得出以下结论:

(1)气候处于相对较冷的环境,植物生长速度缓慢,氨基酸δ13C值处于较高值;气温有上升趋势时,氨基酸δ13C值处于较低值.除Tyr外,温度与各氨基酸的δ13C值呈负相关性.

(2)植物生长情况下,叶片内单个氨基酸δ13C值规律为:δ13CIle>δ13CVal、δ13CIle>δ13CLeu、δ13CTyr>δ13CPhe.

(3)环境胁迫影响下,叶片内Phe含量减少,其他氨基酸含量增加;δ13CTyr相对贫化,其它氨基酸δ13C值相对富集.