不同种子预处理、培养温度及基质对两种沙棘种子萌发的影响*

马迎梅，赵子涵，张娜，张硕，韩峰，孙耀文

(1.内蒙古农业大学 沙漠治理学院，荒漠生态系统保护与修复国家林业局重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010010；2.内蒙古农业大学 草原与资源环境学院，内蒙古 呼和浩特 010010)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)为胡颓子科(Elaeagnaceae)沙棘属灌木，具有耐寒旱和盐碱的特点[1]，可在半干旱地区植被形成、恢复和演替中作为先锋树种[2]。沙棘果实中含有多种营养成分及生物活性物质，具有较高的营养和药用价值[3]。大果沙棘(H.rhamnoidesL.)和中国沙棘(H.rhamnoidessubsp.sinensisRousi)的枝刺较少，果实产量高，成熟时间早，采集时果实不易破裂，在适宜生长区已有大面积栽培利用[4]。沙棘的繁殖通常以有性繁殖建立母株，再以硬或嫩枝扦插的方式进行扩繁培育苗木[5]，但扦插后期存在管理困难、生根和成苗率低等问题[6]。利用种子建立实生苗木并进行繁殖是提高其成活率的一种途径。此外，沙棘病虫害种类发生严重，除药剂防治外，利用杂交选育及转基因等育种方法也是有效提高沙棘抗病虫害能力的重要途径[5]，然而，沙棘种子对其萌发条件极为敏感，若温度、水分等条件不达标易造成发芽率低的结果[7]。究其原因，沙棘种子在储存4～5 a后会失去60%的活力[8]。

研究表明，经低温湿润(-5 ℃和4 ℃)贮藏后，宁夏枸杞(LyciumbarbarumL.)、黑果枸杞(LyciumruthenicumMurray)、细枝山竹子(CorethrodendronscopariumFisch.et Basiner)和泡泡刺(NitrariasphaerocarpaMaxim.)的种子萌发率也较高、萌发速度较快，每种植物的最早萌发时间平均提前3～4 d，是打破这些植物种子休眠的有效方法之一[9]。当采用10～12 ℃的温度培养沙棘种子时，其发芽率仅为13.2%；当采用24～26 ℃的温度培养时，发芽率可提高到95%[10]。张鹏等[11]也发现30 ℃恒温和30 ℃/20 ℃变温培养有利于种子萌发，而15 ℃恒温培养不利于种子萌发。这些不同的种子处理方法和培养温度的设定对沙棘在春季室外或温室内播种具有重要的参考价值。

为了缩短育种周期，培养皿中进行种子萌发再移栽至温室进行加代培育是育种过程中的一种常见的幼苗培养方式。然而，由于培养皿中采用的滤纸和实际生产中的土壤对种子萌发率影响也存在不同程度的差异。例如，温度、种子大小和基质对荒漠植物泡泡刺种子萌发有影响，无论是滤纸还是沙，温度对泡泡刺种子的萌发率、平均萌发时间和萌发率指数的影响显著[12]。弱酸性基质的沙土及沙腐土可使江孜沙棘〔H.gyantsensis(Rousi)Y.S.Lian〕种子的发芽率达80%，发芽势达30%以上，具有促进其种子萌发的作用[13]。厚果鸡血藤〔Derristaiwaniana(Hayata)Z.Q.Song〕种子的出苗率、生根数也因不同播种基质的不同而不同，在珍珠岩基质中的发芽率最高，可达85%，在纯黄土的基质中，平均生根数量最多，每株平均可达10根[14]。

鉴于此，每种植物都具有打破其休眠程度的方法，为了优化和提高沙棘的种子萌发率而利于实生苗的建立而开展沙棘育种，本文选取2个沙棘品种，在培养皿和土壤中分别进行种子萌发实验，通过对它们进行不同水温和稀硫酸浓度浸种预处理后，在不同温度的培养箱内进行培养，测定每种处理组合下一系列种子萌发指标以筛选出适宜沙棘种子萌发的预处理方法和培养条件，以期为探索提高沙棘种子萌发率的方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本文采用2个沙棘品种(大果沙棘和中国沙棘)的种子作为实验材料。种子购于辽宁省森源苗木种子经销处，置于4 ℃冰箱中冷藏(30 d)备用。

1.2 实验设计

于2022年7月，挑选颗粒饱满，大小均匀的沙棘种子，采用0.5%高锰酸钾溶液浸种30 min消毒，用蒸馏水冲洗干净后，分别置于盛有土壤的上下口径为10 cm和高5 cm的花盆和铺有滤纸的培养皿内置床，在恒温培养箱内开展发芽实验，每个处理选择100粒种子进行实验。

实验1对2个品种的沙棘种子(A)进行3种水温为0 ℃(J0：对照)、40 ℃(J40)和50 ℃(J50)浸种(C)后，在培养温度为25 ℃(M25：对照)和35 ℃(M35)的培养箱(B)内进行种子萌发实验(表1)。

表1 因素与水平Tab.1 The experimental treatments and levels

实验2对2个品种的沙棘种子(A)进行了0%(对照)、1%、3%、5%的稀硫酸浸种处理(D)24 h后，用蒸馏水冲洗3～5次，在培养温度为25 ℃(M25：对照)和35 ℃(M35)(B)的培养箱内进行种子萌发实验(表1)。

根据因素水平表(表1)，两种发芽容器间作为裂区，因素A、B和C采用复因子完全随机设计(表2)开展实验，实验在花盆-土壤和培养皿-滤纸的裂区下分别构成12个处理组合，两种容器-基质的裂区共包括24个处理组合，4次重复(表2)。

表2 实验1的复因子完全随机设计表Tab.2 The completely randomized experimental design for experiment 1 with multiple treatments and levels

根据因素水平表(表1)，两种发芽容器间作为裂区，因素A、B和D采用复因子完全随机设计(表3)开展实验，实验在花盆-土壤和培养皿-滤纸的裂区下分别构成16个处理组合，两种容器-基质的裂区共包括32个处理组合，4次重复(表3)。

表3 实验2的复因子完全随机设计Tab.3 The completely randomized experimental design for experiment 2 with multiple treatments and levels

1.3 种子萌发指标测定

待种子全部处理结束后(2022年8月)，每日定时记录种子萌发数并测量胚根、胚芽长度。种子萌发以胚根长度达种子长轴的1/2视为发芽标志并计算下列指标[15]。

发芽率G=(n/N)×100%

①

式中：n为萌发种子数，N为供试种子数。

发芽指数Gi=∑(Gt/Dt)

②

式中：Gt为t日萌发数，Dt为相应的萌发天数。

活力指数Iv=S×Gi

③

式中：S为胚根长度加胚轴长(cm)。

平均发芽速率∑(Gt·Dt)/∑Dt

④

1.4 数据分析

用Microsoft Excel 2021进行数据的录入及整理。将2种培养基质和品种视为固定因子，用SPSS Statistics 20.0对不同沙棘品种和基质下不同水温和稀硫酸浓度的处理的双因素作为主要处理和水平进行了双因素方差显著性分析，采用 LSD 法进行多重比较和显著性检验。绘图时，将不同基质和品种视为固定因子，对不同的浸种方法所产生的差异进行分析，采用Origin 2018进行数据结果的绘图。

2 结果与分析

2.1 不同浸种和培养温度对沙棘种子萌发的影响

2.1.1 浸种温度和培养温度对沙棘种子发芽率的影响

2个沙棘品种的种子在培养皿中(图1A)的发芽率显著低于在土壤中的发芽率(图1B)。在培养皿中，不同浸种温度对大果沙棘种子的发芽率无显著影响，3个浸种温度处理后的2种沙棘种子发芽率均较低。随浸种温度的升高，中国沙棘发芽率呈逐渐下降的趋势，浸种温度为50 ℃时降为0(图1A)。经高温浸种催芽后，35 ℃的培养温度使2种沙棘种子的发芽率接近为0(图1A)。

图1 在培养皿(A和土壤(B)中不同水温浸种和培养温度对2种沙棘种子发芽率的影响

在土壤中，无论采用25 ℃或35 ℃培养时，浸种温度为50 ℃时，大果沙棘的种子萌发率显著下降，其余2种浸种温度都使大果沙棘发芽率随浸种温度的升高而显著增加(P<0.05)，中国沙棘则显著降低(P<0.05)。当浸种温度为50 ℃、培养温度为25 ℃(J50M25)时，大果沙棘的发芽率(45%)比对照(J0M25)高72.2%(图1 B)；当浸种温度为50 ℃、培养温度为25 ℃(J50M25)时，中国沙棘的发芽率降为0(图1B)。

2.1.2 浸种温度和培养温度对沙棘种子发芽指数的影响

培养皿(图2A)中的2种沙棘种子的发芽指数高于土壤中(图2B)。在培养皿中，当培养温度为25 ℃或35 ℃时，随浸种温度的升高，大果沙棘种子的发芽指数呈逐渐上升趋势，当浸种温度为50 ℃时达到最高；中国沙棘种子的发芽指数则呈逐渐下降趋势，从7.15(对照)下降至0.06(J50M25)。2种沙棘种子的发芽指数在培养温度为35 ℃时显著低于25 ℃(图2A)。

图2 在培养皿(A)和土壤(B)中不同浸种温度和培养温度对2种沙棘种子发芽指数的影响Fig.2 Effect of different soaking and culturing temperature on seed germination index of two seabuckthorn species in petri dish(A)and soil(B)，respectively

在土壤中，当培养温度为25℃时，随浸种温度的升高，大果沙棘的发芽指数呈现升高的趋势，处理J40M25和J50M25的发芽指数分别是对照的4.28和4.51倍；中国沙棘则呈相反趋势，处理J50M25的发芽指数为0(图2B)。当培养温度为35 ℃时，中国沙棘种子的发芽指数随浸种温度的提高而呈现下降趋势(P<0.05)。大果沙棘发芽指数在处理J0M35时达到最高(0.70)，比对照高0.57，随后逐渐降低；中国沙棘在40 ℃浸种温度下的发芽指数比对照(0 ℃)降低了48.96%(图2B)。

2.1.3 浸种温度和培养温度对沙棘种子活力指数的影响

2种沙棘种子在培养皿(图3A)中的活力指数显著高于在土壤中(图3B)。在培养皿中，当培养温度为25 ℃时，随浸种温度的升高，大果沙棘种子的活力指数呈现逐渐升高的趋势，而中国沙棘种子的活力指数则下降。浸种温度为40 ℃时，大果沙棘的活力指数达到最高，较对照增加了31.43%；浸种温度为40 ℃时，中国沙棘活力指数仅为对照的21%；浸种温度为50 ℃时，其值降为0。培养温度为35 ℃时，2种沙棘种子的活力指数均接近为0(图3A)。

图3 在培养皿(A)和土壤(B)中不同浸种温度和培养温度对2种沙棘种子活力指数的影响Fig.3 Effect of different soaking and culturing temperature on seed seeds viability of two seabuckthorn species in petri dish(A)and soil(B)，respectively

在土壤中，当培养温度为25 ℃时，随浸种温度的升高，大果沙棘种子的活力指数明显升高，中国沙棘则明显降低。在处理J50M25下的中国沙棘种子的活力指数为0。当培养温度为35 ℃时，2种沙棘种子的活力指数逐渐下降，浸种温度对两种沙棘种子的活力指数无显著影响(P>0.05；图3B)。

2.1.4 浸种温度和培养温度对沙棘初始发芽时间的影响

2种沙棘种子在培养皿(图4A)中的初始发芽时间显著低于在土壤中(图4B)。在培养皿中，当培养温度为25 ℃或35 ℃时，随浸种温度的增加，2种沙棘种子的初始发芽时间显著降低。在J0M35和J50M25处理下，大果沙棘种子的初始发芽时间显著降低(P<0.05)，分别低于对照4和5 d；J40M25和J50M35处理下，大果沙棘种子的发芽时间也较短，但无显著差异。对中国沙棘，除J40M25处理外，其他处理均可减少其初始发芽时间，其中处理J40M35和J50M35下的沙棘发芽时间显著低于对照(P<0.05；图4A)。

图4 在培养皿(A)和土壤(B)中不同浸种温度和培养温度对2种沙棘种子初始发芽天数的影响Fig.4 Effect of different soaking and culturing temperature on initial seed germination days of two seabuckthorn species in petri dish(A)and soil(B)，respectively

在土壤中，当培养温度为25 ℃或35 ℃时，大果沙棘的初始发芽时间随浸种温度的升高而降低，经J0M35、J40M35、J50M25、J50M35处理后的初始发芽时间显著比对照低6 d(P<0.05)。高温浸种催芽和不同的培养温度对中国沙棘的初始发芽时间无显著影响(P>0.05；图4B)。

2.2 不同浓度硫酸浸种和培养温度对沙棘种子萌发的影响

2.2.1 不同浓度硫酸浸种和培养温度对沙棘种子发芽率的影响

经不同浓度硫酸处理后的大果沙棘在培养皿中(图5A)的发芽率高于在土壤中(图5B)，而中国沙棘在两种培养基质中的发芽率呈现出相反的趋势(图5)。在培养皿中，当培养温度为25 ℃时，3种硫酸浓度1%、3%、5%处理下的大果沙棘发芽率显著升高趋势(P<0.05)。处理1%M25、3%M25、5%M25的发芽率均在50%以上，显著高于对照。当处理为1%M25时，大果沙棘发芽率最高(62.5%)。当培养温度为35 ℃时，大果沙棘发芽率均降低至1%，但与对照无显著差异(P>0.05)。中国沙棘发芽率随硫酸浓度的升高呈先下降后上升的趋势。当培养温度为35 ℃时，中国沙棘发芽率降至10%并与对照无显著差异(P>0.05；图5A)。

图5 在培养皿(A)和土壤(B)中不同浓度硫酸浸种和培养温度对2种沙棘种子发芽率的影响Fig.5 Effect of different sulfuric acid soaking concentration and culturing temperature on seed germination rate of two seabuckthorn species in petri dish(A)and soil(B)， respectively

在土壤中，当培养温度为25 ℃或35 ℃时，不同浓度硫酸浸种后的大果沙棘种子发芽率显著低于对照(P>0.05)，其发芽率随硫酸浓度的增加呈逐渐降低的趋势，处理5%M25的为5%，较对照降低了13.05%。中国沙棘经不同浓度的硫酸处理后，发芽率显著低于对照(P<0.05)。随培养温度的升高，中国沙棘的发芽率均下降，但经5%硫酸浸种后发芽率反而上升，处理5%M35较5%M25增加了5.55%(图5B)。

2.2.2 不同浓度硫酸浸种和培养温度对沙棘种子发芽指数的影响

培养皿中(图6A)2种沙棘种子的发芽指数显著高于在土壤中(图6B)。在培养皿中，当培养温度为25 ℃时的2种沙棘种子的发芽指数高于35℃的培养温度。当培养温度为25 ℃时，经1%的硫酸处理后，大果沙棘种子的发芽指数显著升高(P<0.05)，其他浓度处理与对照无显著差异(P>0.05)。中国沙棘种子的发芽指数随硫酸浓度的升高呈先下降后上升的趋势且均显著低于对照(P<0.05)。当处理为5%M25时，发芽指数达到最高(3.99)，但较对照降低了44.11%。当培养温度为35 ℃时，2种沙棘发芽指数均显著降低(图6A)。

在土壤中，当培养温度为25 ℃时，不同浓度硫酸浸种下的大果沙棘种子发芽指数与对照无显著差异(P>0.05)，中国沙棘显著低于对照(图6B)。当培养温度为35 ℃时，不同浓度硫酸浸种下的2种沙棘种子发芽指数均显著低于对照(图6 B)。

2.2.3 不同浓度硫酸浸种和培养温度对沙棘种子活力指数的影响

培养皿中(图7A)2种沙棘种子的种子活力指数显著高于土壤中(图7B)。在培养皿中(图7A)，当培养温度为25 ℃时，1%和3%硫酸浸种后大果沙棘种子的活力指数显著高于对照，中国沙棘的种子活力指数显著低于对照(P<0.05)。当处理为1%M25时，大果沙棘的种子活力指数达到最高，是对照的1.68倍。培养温度为35 ℃时，不同浓度的硫酸浸种处理后2种沙棘种子的活力指数均接近为0，且无显著差异。

图7 在培养皿(A)和土壤(B)中不同浓度硫酸浸种和培养温度对2种沙棘种子活力指数的影响Fig.7 Effect of different sulfuric acid soaking concentration and culturing temperature on seed viability of two seabuckthorn species in petri dish(A)and soil(B)，respectively

在土壤中，当培养温度为25 ℃或35 ℃时，经不同浓度硫酸浸种处理后，大果沙棘种子活力指数无显著差异(P>0.05)；经不同浓度硫酸处理后的中国沙棘种子活力指数显著低于对照(图7B)。

2.2.4 不同浓度硫酸浸种和培养温度对沙棘种子初始发芽时间的影响

2种沙棘种子在培养皿中(图8A)的初始发芽时间显著低于在土壤中(图8B)。在培养皿中，当培养温度为25 ℃或35 ℃时，经由0%M35、1%M25、3%M35处理后的大果沙棘的初始发芽时间显著低于对照3.75、2.0、6.5 d。中国沙棘的初始发芽天数与对照之间无显著差异(P>0.05)(图8A)。在土壤中，除了0%M35处理外，不同浓度的硫酸浸种和培养温度处理对2种沙棘种子的初始发芽天数无显著影响(P>0.05；图8B)。

图8 在培养皿(A)和土壤(B)中不同浓度硫酸浸种和培养温度对2种沙棘种子初始发芽时间的影响Fig.8 Effect of different sulfuric acid soaking concentration and culturing temperature on initial seed germination days of two seabuckthorn species in petri dish(A)and soil(B)， respectively

3 讨论与结论

3.1 讨论

3.1.1 浸种和培养温度及不同培养基质对沙棘种子萌发的影响

温度是种子萌发的重要影响因子，研究发现，浸种温度为50 ℃时，大果沙棘的种子萌发率明显提高，而对江孜沙棘的最适萌发温度为40 ℃[13]，沙棘品种的差异也可能是导致这种差异的主要原因。肖卓琳等[17]还发现浸种后，α-淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶的活性及可溶性蛋白的含量升高而可溶性糖的含量降低是浸种沙棘种子提高其萌发率的方法。蓝花棘豆〔Oxytropiscoerulea(Pall.)DC.〕种子最佳萌发条件是80 ℃水温浸泡5 min，该条件下种子发芽率达97%，且发芽势、发芽指数、活力指数显著高于其他水温的浸种处理[17]。对于百香果(PassifloraeduliaSims.)种子，最佳的浸种水温为65 ℃，且在28～35 ℃变温培养箱内培养可以提高其萌发率[18]。对于白刺花〔Sophoradavidii(Franch.)Skeels.〕硬实种子，以100 ℃热水处理效果最好，在25 ℃培养温度下其发芽率也仅为23.3%，而与其他的种子预处理方法相较而言，热水浸种处理并没有提高其种子萌发[19]。这或许和植物种的差异导致其对温度的敏感性较弱而引起的热刺激效应不敏感相关。本研究发现，当提高培养温度时，大果沙棘种子对于培养温度的反应较敏感，也有利于其萌发，而中国沙棘对温度的反应则较迟缓。在培养皿中，较高的培养温度不利于中国沙棘种子的萌发，但可提高其种子的活力指数。在土壤中，培养温度对2种沙棘种子的发芽率无显著影响，而浸种温度则影响较大。浸种温度的升高对大果沙棘的发芽指数都具有促进作用，而对中国沙棘则有抑制作用。例如，当浸种温度为50 ℃、培养温度为25 ℃(J50M25)时，大果沙棘的发芽率(45%)比对照(J0M25)高72.2%；当浸种温度为50 ℃、培养温度为25 ℃(J50M25)时，中国沙棘的发芽率降为0(图1 B)。在实际生产中，为了克服种子的休眠、提高其发芽率而对不同品种的种子采取同一种处理方法的做法是错误的，因此，通过本文研究发现，对不同的沙棘品种宜采用不同温度的水进行浸种处理来提高其萌发率。

3.1.2 不同浓度硫酸浸种及不同培养基质对沙棘种子萌发的影响

化学物质刺激是另一种打破种子休眠的常见方法，采用浓硫酸浸种不同时长可提高种子的萌发率。例如，经由硫酸处理的长角豆(CeratoniasiliquaL.)种子发芽率达95%且显著高于对照[20]。美国皂荚(GleditsiatriacanthosL.)在硫酸中浸种90 min后可使其发芽率提高到96%。甜刺金合欢(AcaciakarrooHayne)则在硫酸中浸种30 min后提高其发芽率(99%)[21]。通过浓硫酸处理后的刺果甘草(GlycyrrhizapallidifloraMaxim.Prim.)种子发芽率达96.66%、发芽势为97%[22]。百香果种子经浓硫酸浸种8 min后，其发芽率也显著提高[18]。浓硫酸浸泡5 min可促进蓝花棘豆种子萌发[17]。随98%硫酸处理时间的增加，细叶小檗(BerberispoiretiiSchneid.)种子的发芽率、发芽势、活力指数呈先升高后降低的趋势，20 min处理下的发芽率和发芽势最高，15 min处理下的发芽指数最大[23]。由于浓硫酸是一种具有高腐蚀性的强矿物酸，属于危险化学品，实际生产中操作存在安全风险。因此，本文选择了较低浓度的稀硫酸处理，相较而言，本研究中使用的浸种硫酸浓度或许过低导致其对沙棘种子的萌发作用较小。在培养皿中，当培养温度为25 ℃时，3种硫酸浓度1%、3%、5%均可显著提高2种沙棘种子的发芽率和发芽指数。而较高的培养温度和不同浓度的硫酸浸种处理抑制了2种沙棘种子的活力指数。在土壤中，不同浓度的硫酸处理并没有提高2种沙棘种子的发芽率和发芽指数，也不利于提高2种沙棘种子的活力指数。宋超等[24]研究发现，20%硫酸处理后使苦荞麦〔Fagopyrumtataricum(L.)Gaertn.〕种子的发芽率降低了32.5%，发芽指数降低了11.89，经浓硫酸处理50 min后，白刺花硬实种子在25 ℃培养温度下发芽率也仅为45%[19]。硫酸处理后不同大小的发芽率或许与植物种也很相关。

3.1.3 不同处理对于提高沙棘种子初始萌发天数的影响

初始发芽天数是加快沙棘育种进度及提高幼苗生存力的一种体现[25]，不同的处理与培养基质对于提高沙棘初始发芽的天数存在差异。本文发现，土壤对于2种沙棘种子的萌发具有促进作用，但会增加种子初始萌发的天数。在土壤中，当培养温度为25 ℃或35 ℃时，未经浸种处理的大果沙棘发芽需17 d，处理后，不同水温浸种均使大果沙棘发芽天数显著提前6 d，而对中国沙棘的初始发芽天数影响不明显。不同浓度的硫酸浸种和培养温度处理对2种沙棘种子的初始发芽天数均无明显效果。在培养皿中，不同浓度的硫酸浸种和培养温度处理，可比在土壤中缩短2种沙棘种子的发芽天数。处理0%M25和3%M35均可显著提前大果沙棘发芽天数，分别比对照提前3.75和6.5 d；处理J3M25和J5M35也可使其提前，但效果不明显。但对中国沙棘，除J40M25处理外，其他处理均可使发芽天数提前。

3.2 结论

对于大果沙棘，当采用不同水温的浸种处理时，宜在土壤中进行种子萌发，且培养温度设为35 ℃时，发芽率最高；当采用硫酸浸种时，宜用1%的硫酸并在培养皿中温度为25 ℃条件下进行培养来提高其萌发率。对于中国沙棘，无论在土壤或培养皿中，热水浸种对于提高其萌发率效果较差；当采用硫酸浸种时，在培养皿中发芽效果最好的为5%硫酸浸种，25 ℃条件下进行培养，其次是1%硫酸浸种并在25 ℃条件下进行培养。若在土壤中进行种子萌发，效果最好的为不使用硫酸浸种并在25 ℃条件下进行培养。为了缩短沙棘育种周期，不能在生产季节进行种植沙棘时，在培养皿中进行种子萌发并移栽至土壤的过程中，采用培养皿进行种子萌发可以缩短2种沙棘种子的初始发芽时间。