4-氰基吡啶合成异烟酸菌种发酵工艺的研究

周浩，齐勇，刘淑琦，陈洋

（安徽瑞邦生物科技有限公司，安徽 马鞍山 243100）

异烟酸（isonicotinic acid），又名4-吡啶甲酸，分子式为C6H5NO2，它作为一种中间体在各个领域均有应用[1]：在医学上，主要是抗结核原料，如异烟肼、异烟酸酯等；在化工上，主要作为防锈蚀剂、电镀添加剂、PVC 热稳定剂等；异烟酸也可以作为植物生长剂，主要合成植物体内的抗倒胺，用于调节植物代谢[2]。

目前化学法和生物法是合成异烟酸的主要方法。化学法由于存在污染性大、工艺复杂、不符合可持续发展等弊端现已经逐步被生物法所取代。而生物法则是目前流行的采用腈水解酶为催化剂催化转化4-氰基吡啶合成异烟酸[2]，该方法由于绿色环保而逐渐得到众多学者的关注。该转化反应式如下：

有相关研究人员利用生物酶催化合成异烟酸小试，最终异烟酸的生成量可以达到117.9 g/L[3-4]。

本研究利用本公司实验室所构建出的一株产腈水酶的重组大肠杆菌M70进行高密度发酵，并对其发酵条件进行了系统研究，同时鉴定了其催化合成异烟酸的能力，研究了不同碳源、氮源、诱导剂浓度、金属离子种类、金属离子浓度对于发酵条件的影响，同时鉴定了其催化合成异烟酸的能力。

1 实验部分

1.1 材料与方法

菌种：大肠杆菌M70：本实验室构建，保藏于安徽瑞邦生物科技有限公司实验室。

培养基：5 g/L 酵母浸粉，10 g/L 蛋白胨，10 g/L NaCl，琼脂粉15 g/L。

TB培养基：24 g/L 酵母浸粉，12 g/L 蛋白胨，2.4 g/L KH2PO4，16 g/L磷酸氢二钾，5 g/L甘油。

发酵基础培养基：32 g/L氮源，20 g/L碳源，17.5 g/L十二水磷酸氢二钠，3.3 g/L磷酸二氢钾，2 g/L NaCl，1.2 g/L氯化铵，1.5 g/L七水硫酸镁。

注：以上培养基均为卡那霉素抗性，Kana终浓度均为50 mg/L。

仪器：超净工作台，培养箱，pH 计，摇床，灭菌锅，-80°C 冰箱，离心机，5 L 玻璃发酵罐，双联酶反应器，紫外分光光度计，高效液相色谱仪。

1.2 培养方法

1.2.1 菌种活化

使用移液枪，从-80℃冰箱中的甘油管吸取100 μL菌液，随后将其加入到无菌离心管中，再加入900 μL的无菌纯水，用这种方法操作将其稀释至10-6左右，然后使用移液枪将微量稀释的菌液滴入平板表面，再使用涂布棒使其均匀抹开，将其放于培养箱中，培养箱温度设置为37℃，培养12 h。

1.2.2 一级种子培养

将生长好的菌株平板分别利用移液枪枪头挑取单克隆菌落于2 个三角摇瓶中，其中每个摇瓶中包含40mL 一级LB 培养基，将其放于培养箱中，培养箱温度设置为37℃，培养12 h。

1.2.3 二级种子培养

将培养好的2 个一级种子液利用移液枪分别接种到2 个含有150 mL 二级TB 培养基的三角摇瓶中，整个移种过程在超净台上完成，种子液接种量为1%，随后放入摇床培养，培养温度设定为37℃，培养8 h。

1.2.4 发酵培养

发酵罐培养基配好，将碱（50%氨水）配置好，调节初始pH为7.0±0.2。待二级种子培养完成，将其在无菌火焰中接种至5 L发酵罐中，接种完将发酵罐压力调至0.02 MPa左右，空气流量调到5 L/min，待稳定后将溶氧校至100。发酵控制系统中DO 设定在37～43 之间，发酵开始后待溶氧降至50 左右时，将溶氧联动。发酵大约3～4 h后转速大约会达到950 rpm，此时溶氧会有约30 min 左右的跌底，之后会上升20～30 左右。等到溶氧回升至60 以上，转速下降后，此时开始补料，期间注意pH 值会上升至7.2 左右，控制补料保证pH 值不再上升或有下降趋势。补料后3 h左右测OD值，等到OD达到60 以上开始降温加入乳糖诱导。根据比生长速率u来调整补料速度。诱导后每6～8 h取样测OD酶活，待酶活无明显升高时放罐。

比生长速率计算公式：

式中：u—比生长速率；b—T2发酵时间取样OD 值；a—T1发酵时间取样OD值；T1、T2—发酵前后时间。

1.2.5 催化反应

将99.8%的4-氰基吡啶用去离子水配制成体积分数为50%的4-氰基吡啶溶液，水浴伴热保温；将计量好的菌液倒入纯水中，用液碱调pH为7.0±0.2。开始流加4-氰基吡啶水溶液，蠕动泵流速为43 rpm（40 g/min），取样1次/0.5 h测4-氰基吡啶、烟酰胺、异烟酸含量。当4-氰基吡啶含量＞1 000 mg/kg，开始进行过程调控，逐步降低流速或停止流加4-氰水溶液5 min左右，控制4-氰基吡啶含量＜1 000 mg/kg。定时取样检测异烟酸含量。当异烟酸含量＞280 g/L，停止流加4-氰基吡啶水溶液。停止流加4-氰基吡啶水溶液1 h后，取样测4-氰基吡啶、异烟酸、烟酰胺含量。整体反应时间为7～10 h。

1.3 检测方法

1.3.1 pH值和溶氧DO测定

采用梅特勒pH电极和光学溶氧电极进行测定[5]。

1.3.2 菌体量测定

每隔4 h 取样，将样品根据发酵情况进行梯度稀释100～400倍不等，测OD600，将吸光值控制在标准范围0.3～0.7，如超过量程，则扩大稀释倍数[6]。按公式（1）的计算菌体的生物量：

1.3.3 发酵液酶活测定

底物溶液：100 μL（70 g/L 4-氰基吡啶）+690 μL pH=7.0 磷酸盐缓冲溶液（配置方法：称取二水磷酸二氢钠3.04 g，十二水磷酸氢二钠10.92 g，溶于1 L 去离子水中）。

反应：将底物溶液放置于金属浴上，恒温30℃，振荡混合反应。随后加入10 μL稀释后的发酵液，反应时间20 min，利用200 μL 的硫酸停止反应。随后将反应液离心至固液分离。取上清液过0.22 μm微滤膜，后采用液相色谱分析仪进行测定[7]；色谱柱条件：VP-ODS C18 色谱柱，流动相为50%乙腈与2.28 g/L 磷酸二氢钾水溶液。按照1∶10 的比例进行同时洗脱。检测温度30℃，流速1 mL/min，检测波长为230 nm[7]。按照公式（2）计算粗酶活：

式中：c—液相色谱得出的异烟酸浓度，μg/mL；V—反应体积，800 μL反应液和200 μL硫酸；X—反应进样前的稀释倍数；T—反应时间，10 min；v—所加粗酶液体积，10 μL；123.1—异烟酸分子量，g/moL。

发酵液酶活（U/mL）

=粗酶液酶活×反应进样前的稀释倍数X

1.3.4 催化产物异烟酸测定

异烟酸测定预处理方式同上述发酵液处理方式。将其稀释至一定倍数，然后过0.22 μm 微孔滤膜，随后采用液相色谱分析仪进行测定；色谱条件：VP-ODS 不锈钢柱（4.6 mm×250 mm），流动相为（A 溶液∶B 溶液=9∶1）进行洗脱[7]。

A 溶液：水+庚烷磺酸钠+三乙胺+冰乙酸=80 mL+0.1 g+0.02 mL+0.1 mL

B溶液：乙腈

柱温30℃，流速0.8 mL/min，检测波长为265 nm。按照公式（3）计算异烟酸浓度：

式中：ci—待进样溶液中各组分的浓度，μg/mL；N—样品的稀释倍数。

2 结果与讨论

2.1 不同氮源对发酵产腈水解酶酶活的影响

菌体的细胞物质主要由氮源组成，发酵腈水合酶需要寻找一个合适氮源，同时氮源除了帮助菌体生长繁殖的同时，也可以促进目的产物的合成。因此，我们针对氮源进行优化，期望筛选合适氮源。

本试验以发酵培养基为基础，加入20 g/L 的甘油，额外加入32 g/L的氮源，分别利用不同种类的酵母粉以及蛋白胨[8]，来研究这些氮源对M70 生长和产酶的影响，结果如图1所示。

图1 不同氮源对发酵产腈水解酶酶活的影响

由图1可知，最初采用酵母抽提物单配基础盐溶液作为发酵培养基，图中明显可以看到，虽然菌体量达到了80，但是酶活较低，仅仅只有346 U/mL。随后在选择其他不同氮源后，菌体量和酶活呈现了明显上升的趋势。由图1 可以看到，M70 在利用酵母粉作为氮源时，其产酶能力最好，其中安琪酵母粉908 酶活可以达到817 U/mL，OD600达到了157，说明该氮源更利于产酶。同时由图中可以看到，虽然玉米浆干粉和鱼骨蛋白胨对于M70 发酵也有一定效果，但同比酵母粉仍然差距20%，分析原因为该M70 菌株更适合利用酵母粉为氮源，促进其酶的合成，因此我们选择安琪酵母粉908 作为最适氮源。

2.2 不同碳源对发酵产腈水解酶酶活的影响

保持培养基其他条件不变，以安琪酵母粉908作为氮源（添加量为32 g/L），更换不同碳源（添加量为20 g/L），碳源种类例如葡萄糖、麦芽糖、甘油等[8]，来研究这些碳源对M70生长和产酶的影响，结果如图2所示。

图2 不同碳源对发酵产腈水解酶酶活的影响

由图2 可知，M70 菌在利用麦芽糖、蔗糖和淀粉作为碳源时，其菌体量达到了146、151和124，相对应的酶活也平均在550 U/mL 左右，M70 菌株使用葡萄糖和甘油作为碳源效果优于其他有机碳源。OD 值水平相当，酶活分别为778 U/mL 和821 U/mL，OD 值分别为152和165。相比葡糖糖，甘油代谢较慢，利用率高，不会产生碳流分解代谢阻碍，不容易生成乙酸副产物，而其他碳源，如麦芽糖、淀粉等，菌株对其利用效果明显要比甘油差。因此对比后，我们选择甘油作为最适碳源。

2.3 诱导剂用量对发酵产腈水解酶酶活的影响

保持其他反应条件不变，以乳糖作为诱导剂，甘油和安琪908酵母粉作为碳氮源，观察不同诱导剂用量对M70发酵产酶活的影响，结果如图3所示。

图3 诱导剂用量对发酵产腈水解酶酶活的影响

从图3 中看出，利用乳糖诱导，其发酵酶活及菌体量都随乳糖在发酵体系中的终浓度上升而增加，但当乳糖浓度超过8 g/L时，其酶活出现了略微下降的趋势，由此可知，再增加乳糖浓度，将对发酵酶活产生抑制作用，同时还会增加发酵成本，因此基本确定乳糖8 g/L 为最适诱导浓度，此时的酶活及生物量最高，酶活和生物量分别达到892 U/mL和172。

2.4 不同金属离子对发酵产腈水解酶酶活的影响

保持其他反应条件不变，碳氮源分别为甘油和908酵母粉，诱导剂乳糖浓度为8 g/L，观察不同金属离子对发酵产腈水解酶酶活的影响，结果如图4所示。

图4 不同金属离子对发酵产腈水解酶酶活的影响

从图4中看出，不同金属离子对于发酵的酶活差异显著，其中以Fe作为金属离子添加进行发酵，酶活和生物量明显有较大提升，其酶活达到了1 012 U/mL。其中Co和Mn两种金属离子对于发酵酶活有明显抑制作用，酶活仅仅只有100 U/mL。因此我们选择Fe作为最适的金属离子。

2.5 不同Fe离子浓度对发酵产腈水解酶酶活的影响

保持其他反应条件不变，碳氮源分别为甘油和908酵母粉，诱导剂乳糖浓度为8 g/L，采用Fe作为金属离子参与发酵，观察不同Fe 离子浓度对发酵产腈水解酶酶活的影响，结果如图5所示。

图5 Fe离子浓度对发酵产腈水解酶酶活的影响

从图5 中看出，以Fe 离子作为金属离子参与发酵，其发酵酶活及菌体量都随着Fe离子浓度在发酵体系中的终浓度上升而增加，但当Fe 离子浓度超过1 g/L 时，其酶活出现了略微下降的趋势，由此可知，再增加Fe离子浓度，将对发酵酶活产生抑制作用，因此基本确定Fe离子浓度为1 g/L时为最适诱导浓度，此时的酶活及生物量最高，OD和酶活分别达到了185和1 076 U/mL。

2.6 M70菌株发酵优化后的催化合成异烟酸的验证

为进一步验证M70 菌发酵优化后催化合成异烟酸的实际应用情况，我们依据上述实验发酵所得到的发酵液进行催化合成异烟酸验证。从图6可知，采用50%的4-氰基吡啶进行流加反应，前期反应体系中的4-氰基吡啶和异烟酸浓度逐渐增加，同时伴有少量烟酰胺的生成。当反应至7 h左右，反应体系中3-氰基吡啶积累到了1.2 g/L。当反应至7 h 左右，异烟酸浓度已经达到280 g/L，此时反应体系中酶活力下降，需要停止流加反应。因为4-氰基吡啶对于酶有底物抑制，会导致浓度高，底物转化不完全。此时将反应停止至8 h，反应体系中烟酰胺含量达到了285 g/L，4-氰基吡啶转化完全。杂质烟酰胺含量较低，仅有200 mg/kg。以上结果显示，该M70 菌株在优化后合成异烟酸方面具有良好的催化性能。

图6 M70催化4-氰基吡啶合成异烟酸

3 结论

本研究利用本公司自主构建出的一株产腈水解酶的重组大肠杆菌M70进行高密度发酵，期间对其产酶和合成异烟酸的能力做了相关研究，并对其发酵条件、培养基进行优化。通过氮源、碳源、诱导剂浓度、金属离子种类及金属离子浓度等一系列影响因素，确定最优的碳氮源等条件，最终确定了发酵培养基成分，其组成为：32 g/L 安琪908 酵母粉，20 g/L 甘油，17.5 g/L 十二水磷酸氢二钠，3.3 g/L 磷酸二氢钾，2 g/L NaCl，1.2 g/L 氯化铵，1.5 g/L七水硫酸镁，并利用乳糖为诱导剂，浓度为8 g/L，采用Fe作用发酵的金属离子，添加量为1 g/L时，其OD 和酶活最高，达到了185 和1 076 U/mL。该菌在发酵条件优化后，酶活提高了40%左右。同时最终利用其合成异烟酸，异烟酸生成达到了285 g/L。因此该菌在催化4-氰基吡啶合成异烟酸的生产中具有积极作用，对生物合成异烟酸具有重要意义。