美洲大蠊提取物体外对肝癌耐药细胞BEL-7402/5-FU自噬和侵袭转移的影响

马璟婷，周杰，李彩琳，吴定宇，彭芳✉

（1. 大理大学药学院，云南 大理 671000； 2. 云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南 大理 671000）

肝细胞癌（hepatocellualar carcinoma，HCC），简称肝癌，是世界范围内最常见的癌症之一，也是全球癌症相关死亡的第三大原因［1］。近年来，全球大部分国家和地区的肝癌发病率呈现上升趋势［2-3］。我国每年肝癌的增加患者达到40 万人，病死率是全球病死率的2.54 倍［4-5］。HCC 的发生是一个涉及多种危险因素的复杂过程，治疗方法主要包括药物化疗和手术治疗，但肝癌患者在接受药物化疗后易产生耐药性，甚至是产生多药耐药性（multiple drug resistance，MDR）［6］。MDR的产生不仅使本身治疗的药物产生耐药，可能还会使其他具有不同结构和作用机制的化疗药物也产生耐药性，已成为肿瘤化疗成功的最大障碍［7］。目前，很多西药在逆转耐药性方面多针对单一机制入手，但其不良反应大，在临床应用中有很大的局限性。

中药具有高效低毒、多靶点、特异性强等特点，可通过多个途径逆转肿瘤的MDR［8］。美洲大蠊（Periplaneta americanaL.）作为蜚蠊科体积最大的药用昆虫在我国古代中医药书目中早有记载。本研究团队的前期实验研究表明，美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏具有逆转肝癌多药耐药的效果，且初步探明其可能是通过减少药物外排、促进细胞凋亡、减少多药耐药相关基因和酶介导多药耐药途径中相关基因的mRNA及其蛋白的表达等方式逆转肝癌的MDR［9-11］，但对产生了MDR 的恶性肿瘤组织的高浸润和高转移的特性研究尚未见报道。因此，本研究以肝癌敏感细胞BEL-7402 和耐药细胞BEL-7402/5-FU（5-fluorouracil，5-FU）为试验对象，并给予CⅡ-3 和脱脂膏进行干预，以此来探讨这些美洲大蠊提取物是否具有影响耐药细胞自噬和侵袭转移的作用及其可能的作用机制。

1 材料

1.1 细胞株

人肝细胞癌敏感细胞株BEL-7402、5-FU人肝细胞癌细胞株（BEL-7402/5-FU），批号均为：MXC050，由上海美轩生物科技有限公司提供。

1.2 主要样品与试剂

美洲大蠊提取物脱脂膏系褐色黏稠膏状，得率约为75.18%，批号：P14805-20171023，由美洲大蠊干燥虫体的醇提物制备的浸膏制得；美洲大蠊脱脂膏进一步纯化粗提取得CⅡ-3为黄褐色冻干粉末，得率约为0.2%，批号：17102125，以上两种均由大理大学昆虫生物医药研究院张成桂博士提供。5-FU（美国 Sigma公司，批号：WXBC0190V）；索拉非尼（北京索莱宝科技有限公司，批号：819C021）；0.25% Trypsin-EDTA 胰酶（MESGEN 公司，批号：092619200313）；ECL 试剂盒（南京建成生物科技有限公司，批号：092019200325）。

1.3 主要仪器

PCR 仪（美国伯乐公司，型号：785BR15145）；激光共聚焦显微镜（德国徕卡公司，型号：Leica TCS SP8 X）；酶标仪（美国Bio-Teck公司，型号：225939）。

2 方法

2.1 肿瘤细胞的培养

常规培养BEL-7402 细胞，并选择对数生长期的细胞进行试验。

2.2 主要药品配制

用二甲亚砜配制母液为100 mg/mL 的美洲大蠊提取物CⅡ-3 和脱脂膏，索拉菲尼则配成10 mg/mL 的药物母液，以上均置于4 ℃冰箱保存备用。实验时用培养基倍比稀释为实验所需的各个浓度。

2.3 分组与给药

试验分为敏感组、耐药组、索拉菲尼组、CⅡ-3 组和脱脂膏组。其中，敏感组加入BEL-7402 细胞，其余各组加入BEL-7402/5-FU 细胞。给药时，敏感组和耐药组加入常规培养基，索拉菲尼组给予3 μg/mL索拉菲尼，CⅡ-3 组和脱脂膏组则分别加入200 μg/mL CⅡ-3和脱脂膏。

2.4 免疫细胞化学法检测自噬标志性蛋白p62的生成

取对数生长期的BEL-7402和BEL-7402/5-FU细胞经处理后制成单细胞悬液，然后按2 × 106个/皿的细胞密度接种于事先放有细胞爬片的12 孔板中继续培养24 h。随后按照上述实验分组分别加入含相应浓度药物的培养基继续培养48 h。经过一定的孵育、清洗、显色、脱水、封片等系列处理后，在倒置显微镜下观察拍照。通过Image J 软件计算灰度值，结果图采用Graphpad Prism 8软件绘制。

2.5 激光共聚焦检测细胞自噬蛋白LC3形成

细胞前期处理及加受试药等操作基本同“2.4”项，按每皿3 × 104个的细胞密度进行接种。随后按照LC3检测的基本程序进行操作。第2 天于激光共聚焦显微镜下拍照观察。

2.6 实时荧光定量法检测细胞自噬和侵袭转移相关因子mRNA水平

取对数生长期的BEL-7402 和BEL-7402/5-FU 细胞制成单细胞悬液，按每皿1 × 107个的细胞的密度接种于皿中，按照上述分组给药。加入Trizol 试剂提取RNA，然后按第一链合成试剂盒说明进行操作。分别在42 ℃ 60 min、80 ℃ 10 min 的反应条件进行逆转录。随后在建立20 μL 反应体系、落实自噬和侵袭转移相关因子引物后观察RT-PCR 反应，并按照以下公式计算各基因的相对表达量。引物序列表见表1 和表2。

表1 自噬相关因子引物序列表

表2 侵袭转移相关因子引物序列表

2.7 划痕试验检测细胞侵袭转移能力

取对数生长期的BEL-7402 以及BEL-7402/5-FU 制成单细胞悬液后，按6 × 105个/皿的细胞密度接种于在底部（背面）画直线的小皿中，按照上述分组给药进行处理。按划痕试验操作步骤进行操作，并分别在24、48 h显微镜下拍照记录划痕的愈合情况，并按照以下公式计算细胞划痕的愈合率。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 各组对p62蛋白水平的比较

结果显示，与敏感组相比，耐药组细胞中p62 蛋白表达量明显降低（P＜ 0.01），提示耐药组细胞自噬作用增强。给予索拉菲尼、CⅡ-3 和脱脂膏后，耐药细胞中p62 蛋白表达量则显著升高（P＜ 0.01），表明CⅡ-3 和脱脂膏可明显抑制肝癌耐药细胞的自噬作用。见图1和表3。

表3 各组细胞中p62蛋白水平比较（±s）

注：与敏感组比较，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；与耐药组比较，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

p62（相对表达量）0.16 ± 0.01 0.09 ± 0.01**0.11 ± 0.01**#0.13 ± 0.01**##0.12 ± 0.01**##组别敏感组耐药组索拉非尼组CⅡ-3组脱脂膏组n6 6 6 6 6

3.2 各组对LC3蛋白形成的影响

本研究采用荧光标记法来观察LC3蛋白。与敏感组相比，耐药组细胞具有更多的绿色荧光斑点，提示耐药组细胞可能具有更强的自噬作用。在使用CⅡ-3和脱脂膏处理后，耐药组中的绿色荧光部分减少，表明CⅡ-3 可显著抑制细胞的自噬作用，而脱脂膏组的作用效果并不显著。见图2。

图2 各组对细胞中LC3蛋白形成的影响（× 200）

3.3 各组对自噬相关因子mRNA的影响

与敏感组细胞相比，耐药组中自噬相关因子自噬相关蛋白5（autophagy related 5，ATG 5）、自噬相关蛋白7（autophagy related 7，ATG 7）、磷酸肌醇-3-激酶3（phosphoinositide-3-kinase class 3，PIK3C3）、BECLIN 蛋白（BECLIN protein，BECLIN）、LC3B 均呈现高表达，而p62的表达量显著降低；给予CⅡ-3和脱脂膏处理后，可显著抑制ATG5、PIK3C3、BECLIN、LC3B的表达，升高耐药组中p62的表达。其中，CⅡ-3对ATG7的表达无显著影响，而脱脂膏则可明显升高其表达。见表4。

表4 各组对自噬相关因子mRNA的影响比较（±s）

表4 各组对自噬相关因子mRNA的影响比较（±s）

注：与敏感组比较，*P ＜ 0.05， **P ＜ 0.01；与耐药组比较，#P ＜ 0.05， ##P ＜ 0.01；与索拉非尼组比较，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01。

组别敏感组耐药组索拉菲尼组CⅡ-3组脱脂膏组p62 1.86 ± 0.25 1.00 ± 0.00*0.14 ± 0.02*##0.74 ± 0.14##1.61 ± 0.29**##n 6 6 6 6 6 ATG7 0.8 ± 0.07 1.00 ± 0.00 1.12 ± 0.21*0.96 ± 0.15 1.52 ± 0.31*##△ATG5 0.85 ± 0.11 1.00 ± 0.00 0.25 ± 0.05**##0.63 ± 0.10**##0.52 ± 0.10**##PIK3C3 0.49 ± 0.09 1.00 ± 0.00**0.29 ± 0.05*##0.42 ± 0.14##△0.74 ± 0.15*##△△BECLIN 0.25 ± 0.05 1.00 ± 0.00**0.13 ± 0.01**##0.10 ± 0.02**##△0.22 ± 0.03**##LC3B 0.59 ± 0.06 1.00 ± 0.00**0.30 ± 0.03**##0.83 ± 0.05**#0.61 ± 0.19#

3.4 各组对侵袭转移相关因子mRNA的影响比较

与敏感组细胞相比，耐药组中侵袭转移相关因子除哺乳动物雷帕霉素靶点（mammalian target of rapamycin，mTOR）的表达降低外，金属基质蛋白酶2（metal matrix proteinase-2，MMP-2）、金属基质蛋白酶9（metal matrix proteinase-9，MMP-9）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）蛋白、真核细胞翻译起始因子4E结合蛋1（eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4EBP1）的表达均显著升高；给予CⅡ-3和脱脂膏后可显著降低耐药细胞中MMP-9、Akt、4EBP1 的表达，而升高MMP-2、mTOR的表达。以上结果表明CⅡ-3和脱脂膏均可影响耐药肝癌细胞的侵袭转移因子。见表5。

表5 各组对细胞侵袭相关因子mRNA的影响比较（±s）

表5 各组对细胞侵袭相关因子mRNA的影响比较（±s）

注：与敏感组比较，*P ＜ 0.05， **P ＜ 0.01；与耐药组比较，#P ＜ 0.05， ##P ＜ 0.01；与索拉非尼组比较，△P ＜ 0.05，△△P ＜ 0.01。

组别敏感组耐药组索拉非尼组CⅡ-3组脱脂膏组4EBP1 0.72 ± 0.12 1.00 ± 0.00*0.14 ± 0.02#0.80 ± 0.09△0.29 ± 0.05#n 6 6 6 6 6 MMP-2 0.13 ± 0.05 1.00 ± 0.00**0.02 ± 0.01##1.43 ± 0.57**#△△1.20 ± 0.19**△△MMP-9 0.11 ± 0.02 1.00 ± 0.00**0.00 ± 0.01##0.65 ± 0.14**##△△0.05 ± 0.01##mTOR 1.25 ± 0.2 1.00 ± 0.00*0.24 ± 0.05*##1.15 ± 0.39 1.25 ± 0.41△Akt 0.48 ± 0.12 1.00 ± 0.00**0.18 ± 0.04**##0.36 ± 0.09##△0.24 ± 0.13*##△

3.5 各组对细胞侵袭转移能力的影响比较

在划痕试验中，细胞侵袭转移能力越强细胞划痕的愈合速度越快，愈合率越高。和敏感细胞相比，耐药细胞在24、48 h时细胞的划痕愈合率较高，表明耐药细胞比敏感细胞具有更强的侵袭转移能力；给予阳性药索拉菲尼和CⅡ-3作用24、48 h后划痕愈合率显著降低，说明CⅡ-3 可显著抑制细胞的侵袭转移，而脱脂膏则无显著的抑制效果。见表6。

表6 各组对细胞划痕愈合率的影响比较（±s）

表6 各组对细胞划痕愈合率的影响比较（±s）

注：与敏感组比较，*P ＜ 0.05；与耐药组比较，#P ＜ 0.05；与索拉非尼组比较，△P ＜ 0.05。

划率组别48 h 55.98 ± 5.20 75.06 ± 9.79*41.40 ± 3.45*#50.13 ± 5.77#△67.51 ± 6.92*△n 6 6 6 6 6 24 h 23.79 ± 5.77 38.69 ± 6.20*27.01 ± 4.37#28.15 ± 5.60#36.21 ± 6.53*△敏感组耐药组索拉非尼组CⅡ-3组脱脂膏组

4 讨论

针对目前高发的HCC，临床上治疗主要手段还是以化学治疗为主，如目前临床效果较好的索拉非尼。但由于化学治疗药物的长期使用造成了MDR，而新的药物研究成本大，研究时间长等使得我国HCC 目前的临床治疗现状不容乐观。作为HCC 发病率大国，提高HCC的有效治疗，增加有效治愈率，克服HCC的多药耐药等已经成为了HCC治疗中亟待解决的问题。而诸多中药具有高效、低毒、作用靶点并不单一的特点，美洲大蠊作为昆虫药物具有极其重要的作用，其化学成分非常丰富，主要含蛋白类、多肽类、糖类、脂肪酸类化合物［12-14］。丰富的化学成分为美洲大蠊发挥多样的药理活性提供了可能［15-17］。本研究团队通过几十年的研究发现，美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏具有抗肿瘤的作用，也有一定的对抗肿瘤MDR 的作用［9-11，18-19］，而对CⅡ-3和脱脂膏是否影响肿瘤的自噬与侵袭转移则没有深入的研究。因此，笔者就是针对这一问题展开研究。

细胞自噬是一种自我降解的机制，是依赖溶酶体的自我消化过程。其中LC3 蛋白和p62 蛋白均可作为在自噬起始阶段自噬体的标记蛋白，且在肝癌组织及癌旁组织中均呈现高表达状态［20］。LC3是自噬体与溶酶体融合的关键分子。在自噬过程中，LC3 被蛋白酶ATG4 裂解产生LC3-Ⅰ，与磷脂酰乙醇胺结合形成LC3-Ⅱ，而LC3-Ⅱ能与p62 蛋白相互作用，p62 能把膜结合的LC3-Ⅱ蛋白将其送至自噬小体进行降解。另外，p62 蛋白本身也能被自噬降解，因此p62 蛋白在细胞质中的积累被用作自噬通量减少的标志［21］。自噬相关基因ATG 家族在自噬过程中也扮演了极其重要的角色，其中ATG5 能促进自噬前体膜的延伸，如果其本身突变，还会影响自噬体的形成。ATG7在自噬体的形成过程中起到了重要的调控作用。本实验用肝癌敏感细胞BEL-7402 和肝癌耐药多药耐药细胞BEL-7402/5-FU 为试验对象，通过免疫细胞化学法和激光共聚焦试验观察细胞的自噬蛋白表达，通过RT-PCR检测自噬相关因子的表达。实验结果显示，美洲大蠊提取物CⅡ-3 和脱脂膏可对自噬相关因子产生不同程度的影响，其中对ATG5 影响最为明显，而对ATG7以及p62 的影响较小，表明美洲大蠊提取物可能只能作用于自噬的某些阶段。

侵袭转移在肿瘤细胞生命活动中具有重要作用。MMP家族可以通过降解胶原蛋白和层粘连蛋白来促进肿瘤侵袭和转移［22-24］，而这个家族蛋白中尤以MMP-2和MMP-9与肿瘤的转移浸润密切相关，两者在正常细胞及癌细胞中的高表达均能增加细胞的侵袭转移能力［12，25-27］。另外mTOR、Akt、4EBP1等相关因子也能影响肿瘤细胞的凋亡、侵袭转移等一系列生命活动［13］。因此，本研究通过检测侵袭转移相关因子的表达和利用划痕试验检测细胞侵袭转移能力来间接反映美洲大蠊提取物CⅡ-3和脱脂膏是否通过影响细胞的侵袭转移来发挥抗HCC的作用。试验结果表明耐药肝癌细胞具有更强侵袭转移能力，且美洲大蠊提取物能抑制耐药细胞的侵袭转移，但仅仅能影响部分相关因子。本研究主要是基于mRNA水平进行检测，仍存在一定的局限性，在后续实验中，还需要对更多检测水平进行研究并进一步探索美洲大蠊提取物对自噬和侵袭转移的体内影响，为美洲大蠊提取物逆转肝癌 MDR的临床研究奠定基础。