枳Rboh基因家族全基因组鉴定及表达分析

梁梦鸽, 马铭远, 刘 腾, 徐小勇

(扬州大学园艺园林学院, 江苏扬州 225009)

植物呼吸爆发氧化酶(respiratory burst oxidase homologue, Rboh)又称植物NADPH氧化酶,是哺乳动物吞噬细胞NOX复合体催化亚基gp91phox的同源物[1]。它是一种以细胞质NADPH为电子供体,催化胞外氧气生成超氧阴离子的一种氧化还原酶。有证据[1-3]表明,由其介导的活性氧参与植物的生长发育、生物胁迫和非生物胁迫响应,其活性受钙离子、蛋白磷酸化、ABA等因子调控。因此Rboh被认为是植物活性氧调控网络的“核心节点”[4-5]。

Rboh由多基因编码,在基因组测序和生物信息学技术的支撑下,越来越多的植物Rboh家族完成了全基因组鉴定。在模式植物拟南芥中, Rboh是由10个基因组成多基因家族,不同的基因成员在组织分布、基因表达和调控模式等方面存在明显差异[6]。此外,在水稻、大豆、棉花、葡萄、草莓、苹果、辣椒等植物上也完成了Rboh基因家族的鉴定与生物信息学分析[7-13]。枳(PoncirustrifoliataL.)是芸香科枳属小乔木,具有抗寒、抗旱、适应性强等优点,是我国目前应用最多、最广的柑橘砧木。最近,高质量的枳基因组信息已公布[14], 这为运用生物信息学方法鉴定枳基因家族奠定了基础。鉴此,本研究利用生物信息学手段鉴定枳中Rboh基因家族成员,分析其理化特征、基因结构、保守域信息、系统进化关系、启动子顺式作用元件和组织表达模式,以期挖掘可能与逆境响应相关的Rboh基因,为枳Rboh基因的克隆及功能研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 枳Rboh基因家族鉴定

枳基因组序列、蛋白质序列及其注释信息均下载自CPBD数据库(http://citrus.hzau.edu.cn/)。从植物参考基因组数据库Ensembl (http://plants.ensembl.org)下载拟南芥、水稻的基因组相关数据(基因组序列和注释信息)。

以拟南芥的10个Rboh蛋白序列作为查询序列,设置检索阈值E-value 为e-5, 采用TBtools软件BLAST搜索枳蛋白质数据库,获得候选的枳Rboh蛋白序列; 然后在Pfam 数据库(http://pfam.xfam.org/)中分别下载NADPH_Ox ferric、 Ferric_reduct、FAD_binding_8和NAD_binding_6结构域的HMM 文件(PF08414、PF01794、PF08022 和PF08030), 并利用HMMER v3.3.2软件构建隐马尔科夫模型,在候选枳Rboh蛋白序列中搜索含有这4个结构域的序列; 最后通过NCBI和SMART数据库(http://smart.embl-heidelberg.de/)进行蛋白质保守结构域的鉴定确认。柑橘类其他基因组中Rboh基因家族成员数目采用相同方法进行确定。通过在线工具Expasy-ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)对枳Rboh基因家族成员进行蛋白质理化性质预测。使用在线软件Plant-mPLoc (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)和CELLO v2.5 (http://cello.life.nctu.edu.tw/)对枳Rboh蛋白家族进行亚细胞定位预测。

1.2 枳Rboh基因家族基因结构、保守结构域和motif 分析

通过在线工具MEME (https://meme-suite.org/meme/tools/meme)进行motif分析, motif 数目设置为10个,其他均为默认,保守结构域信息通过NCBI-CDD在线工具下载,并利用TBtools 软件对基因结构、保守结构域和motif进行可视化作图。

1.3 枳、拟南芥和水稻Rboh基因家族的系统进化树分析

使用枳、拟南芥和水稻Rboh 蛋白质序列,利用MEGA X软件进行多序列比对,并采用最大似然法(maximum likelihood, ML)构建系统进化树, Bootstrap 参数设置为1 000, 其他参数选择默认。利用Evolview 在线软件对系统发生树进行编辑和美化。

1.4 枳、拟南芥和水稻Rboh基因家族的共线性分析

利用MCScanX 程序对枳、拟南芥和水稻基因组信息进行比对,并通过TBtools 软件Multiple SystenyPlot工具分析共线性关系。

1.5 枳Rboh基因启动子顺式作用元件分析

选取枳Rboh基因转录起点上游2 000 bp长度的序列作为分析顺式作用元件的主要启动子区域,利用在线工具PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)中获得每个枳Rboh基因启动子区域中所有的顺式作用元件,并筛选出重要的响应元件,最后通过Excel进行统计分析。

1.6 枳Rboh基因组织表达分析

在柑橘泛基因组数据库网站(http://citrus.hzau.edu.cn/)获取该基因家族的组织RNA-seq表达数据,使用TBtools软件绘制基因表达热图。

2 结果与分析

2.1 家族成员鉴定及其相应蛋白质的理化性质预测

利用BLAST和HMM方法,在枳基因组中共鉴定到7 个Rboh基因成员(表1), 并根据其位置命名为PtrRbohA—PtrRbohG。其中,PtrRbohA位于1号染色体,PtrRbohB和PtrRbohC位于3号染色体,PtrRbohD位于4号染色体,PtrRbohE位于8号染色体,PtrRbohF和PtrRbohG位于未知染色体(图1)。枳Rboh基因编码的氨基酸长度介于684-946之间,分子量在78.83～107.39 ku之间,等电点在8.71～9.32之间。此外,枳Rboh蛋白不稳定指数介于38.08～49.27范围,其中PtrRbohC和PtrRbohE低于40, 表明这2个Rboh蛋白是稳定的。使用在线软件Plant-mPLoc和CELLO进行亚细胞定位预测,结果显示所有枳Rboh蛋白均位于细胞膜上。这暗示枳Rboh蛋白在细胞膜上可能参与活性氧的产生。

图1 枳Rboh基因家族的染色体定位Fig.1 Chromosomal localization of the PtrRboh genes

表1 枳Rboh家族成员基本信息Tab.1 The details of the seven predicted PtrRbohs

2.2 基因结构、保守结构域和motif 分析

由图2可见,枳Rboh基因共有12～15个外显子、11～14个内含子,总体而言基因结构在基因之间差异很大,特别是PtrRbohC基因。保守结构域分析表明,枳Rboh蛋白有4～5个保守结构域。其中6个蛋白质具有相同的保守结构域,暗示这6个基因可能具有相似的生物学功能。值得注意的是, PtrRbohC缺少EF-hand保守域。motif分析发现,枳Rboh蛋白含有8～10个motif; 与保守结构域分析相似,除PtrRbohC缺失2个motif外,其他枳Rboh蛋白均具有相同的motif。

图2 枳Rboh基因家族进化树、基因结构、保守结构域和motif 分析Fig.2 Evolutionary relationships, gene structures, conserved domains and motifs of PtrRbohs

2.3 系统进化树及共线性分析

为探究枳Rboh基因与其他模式物种的进化关系, 分析了拟南芥Rboh (10个)、水稻Rboh (9个)和枳Rboh (7个)蛋白序列, 并构建了系统进化树(图3)。根据进化树结果,将其分为5个亚组。PtrRbohD和PtrRbohF在第1组; PtrRbohG、PtrRbohA和PtrRbohB分别位于第2、3、4组; PtrRbohC和PtrRbohE则在第5组。这说明枳Rboh基因家族可能存在功能多样性。共线性分析结果显示,枳和拟南芥Rboh基因间存在7对共线性关系,而枳和水稻Rboh基因间有4对共线性关系(图4)。这表明这些Rboh基因对可能来自共同的祖先,具有相似的功能。结合系统进化树分析结果,可发现枳Rboh基因与拟南芥Rboh基因具有更近的亲缘关系。

图3 枳、拟南芥和水稻的Rboh基因家族进化树分析Fig.3 Phylogenetic tree of Rbohs in P.trifoliata, Arabidopsis thaliana and Oryza sativa

图4 拟南芥、水稻与枳Rboh基因的共线性关系Fig.4 Collinearity relationships of Rboh genes among P.trifoliata, Arabidopsis thaliana and Oryza sativa

2.4 启动子区域顺式作用元件分析

顺式作用元件分析结果表明,枳Rboh基因启动子区域共有38种顺式作用元件,包括生长发育元件、激素响应元件和逆境响应元件3大类型(图5)。 其中逆境响应元件类型最多,共24个。生长发育元件主要有分生组织特异性元件(CAT-box)、生理周期调控元件(circadian)和胚乳表达调控元件(GCN4_motif)等; 激素响应元件主要有脱落酸响应元件(ABRE)、茉莉酸甲酯响应元件(TGACG-motif和CGTCA-motif)和水杨酸响应元件(TCA-element)等; 逆境响应元件主要有光响应元件(Box4、G-Box等)、厌氧诱导元件(ARE)和干旱诱导元件(MBS)等。值得注意的是,所有枳Rboh基因启动子上存在光响应元件和茉莉酸甲酯响应元件;PtrRbohE启动子上特有胚乳表达调控元件和细胞周期调控元件;PtrRbohG启动子上特有种子特异性调控元件。

图5 枳Rboh基因启动子中顺式作用元件的种类与数量Fig.5 The type and number of cis-acting elements on putative promoters of PtrRbohs

2.5 组织表达分析

利用柑橘泛基因组数据库,对7个枳Rboh基因的组织表达模式进行了分析,结果表明Rboh基因表达具有组织特异性(图6)。其中,PtrRbohD和PtrRbohB在所检测的叶片、幼嫩胚珠、成熟胚珠、幼果肉、成熟果肉及种子中的表达量均较高。而PtrRbohA在所检测6个组织中的表达量均较低。此外,值得注意的是,PtrRbohE仅在成熟胚珠中检测到表达。总体而言, 7个枳Rboh基因在成熟胚珠中表达量较高。

图6 枳Rboh基因组织表达分析Fig.6 Expression patterns of PtrRbohs in various tissues

3 讨论

Rboh可介导产生具有信号作用的活性氧,在调节植物的生长发育、应答生物或非生物胁迫反应中起着尤为重要的作用。而枳Rboh基因家族研究尚未见报道。本研究通过全基因组鉴定在枳中共发现7个Rboh基因(PtrRbohA—PtrRbohG), 其他柑橘类基因组Rboh基因数为6～7个,如柚6个、柠檬6个和甜橙7个[15]。有趣的是,在葡萄和草莓等植物中,同样鉴定到7个Rboh基因[10-11], 而一些主要农作物中,具有较多数量的Rboh基因,如棉花26个和大豆17个[8-9]。枳Rboh基因在染色体上的分布不均匀,共有12～15个外显子和11～14个内含子,亚细胞定位预测结果表明7个枳Rboh蛋白均位于细胞膜上,这些特征与前人[9,13]研究结果一致。

枳Rboh基因家族成员均含有Rboh典型的4个功能保守结构域,即NADPH 结合结构域、FAD结合结构域、铁还原酶NAD结合结构域和铁还原酶跨膜组件结构域,揭示枳Rboh基因功能的保守性。系统进化树分析分成5个亚组,枳Rboh基因分布在每个亚组内,与拟南芥Rboh基因有更近的亲缘关系,共线性分析也证实了这一结果。顺式作用元件分析结果表明,多数枳Rboh基因其启动子区域富含茉莉酸甲酯响应元件、脱落酸响应元件等激素响应元件。由此可见,枳Rboh基因可能受茉莉酸甲酯或脱落酸调控,但有待试验证实。最近,有研究人员[16]发现木豆Rboh基因家族成员其启动子区域也富含茉莉酸甲酯响应元件,茉莉酸处理后木豆CcRbohB和CcRbohG显著上调表达。

基于柑橘泛基因组数据库的基因表达数据,本研究发现枳Rboh基因表达具有组织特异性。在这7个基因中,PtrRbohD在所检测的组织中表达量均较高。作者注意到PtrRbohD与拟南芥AtRbohD分在同一组,而AtRbohD在拟南芥各器官中组成型表达,且参与各种胁迫响应[17], 暗示着PtrRbohD可能具有相似功能。此外,本研究还发现PtrRbohE特异表达于成熟胚珠,而进化树中与PtrRbohE亲缘关系最近的拟南芥AtRbohH和AtRbohJ特异表达于花粉[6], 故认为所检测的成熟胚珠中可能有花粉。但PtrRbohE在花粉中是否也有所表达有待于进一步探究。

4 结论

在枳中共鉴定到7个Rboh基因(PtrRbohA—PtrRbohG), 其理化特征、基因结构具有多样性; 枳Rboh基因含有Rboh典型的4个功能保守结构域; 枳Rboh基因启动子区域共有38种顺式作用元件;枳Rboh基因表达具有组织特异性。