甲状腺乳头状癌组织miR-221-3p表达与淋巴结转移危险因素分析*

梁 阳，邓一林，吴佩玲，毛 俐△，汪广杰

1.中国人民解放军西部战区总医院 病理科（成都 610083）；2.成都医学院 公共卫生学院（成都 610500）；3.中国人民解放军西部战区总医院 肿瘤科（成都 610083）

近年来，甲状腺癌已经成为我国常见的恶性内分泌肿瘤，约70%～80%甲状腺癌属于甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）[1]。PTC易局部浸润和远处转移，因此寻找新的预后诊断标志物，对PTC患者临床预后有重要意义。miRNA是一类非编码短链RNA的总称，多数情况下通过结合靶基因mRNA 3'-非翻译区，导致mRNA降解或翻译沉默[2-3]。文献研究[4-5]发现，miR-221-3p在多种肿瘤中异常表达，并影响肿瘤患者临床预后。目前研究[6]仅发现BRAF V600E基因在PTC中异常表达，且对PTC预后研究甚少。本研究旨在探讨miR-221-3p在PTC组织中的表达水平及其与患者临床病理特征和预后之间的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2020 年10 月至2021 年7 月西部战区总医院收治的PTC患者26 例。纳入标准：1）首次诊治，术前未接受任何治疗；2）均经甲状腺全切或次全切手术后病理学确诊为PTC；3）临床病例资料完整，年龄≥18 岁；4）签订知情同意书。排除标准：1）合并甲状腺其他疾病或其他部位恶性肿瘤者；2）有精神疾病者。PTC患者中，男7 例，女19 例；年龄26～84（46.23±12.67）岁；肿瘤最大直径（1.55±1.34）cm；淋巴结转移9 例。另选取经超声穿刺病理活检明确为健康者23 例作为对照组，其中，男6 例，女17 例；年龄26～60（41.89±10.31）岁。组间性别、年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05）。本试验研究经成都医学院伦理委员会批准（伦理审批号：CMCEC-2022 No.18），所有受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 冰冻免疫组织化学染色 对临床切除的甲状腺组织行局部解剖术，区分正常甲状腺组织及PTC组织，分别切取PTC组织及甲状腺组织行冰冻切片检查，连续切片3 张，切片厚度为5 μm，行苏木素-伊红染色。另分别切片行冰冻免疫组织化学染色，选取抗体为CK19，试剂盒由上海赛诺特生物技术有限公司提供。免疫组织化学染色具体步骤为：1）将冰冻切片粘附载玻片上，中性福尔马林固定5 s，PBS冲洗10 s；2）用封闭剂封闭2 min，PBS冲洗20 s；3）滴加一抗CK19 10 μL，37 ℃温箱孵育3 min，PBS冲洗3 次；4） 滴加二抗10 μL，37 ℃温箱孵育3 min，PBS冲洗3 次；5）高敏DAB显色，观察显色情况，用自来水冲洗，终止显色；6）用苏木精复染15 s，流水冲洗，封片。CK19 阴阳性判读标准：细胞胞浆出现棕黄色判读为阳性，反之则为阴性。

1.2.2 实时荧光定量PCR 采用实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）测定受试者甲状腺组织miR-221-3p表达水平。收集PTC和正常甲状腺新鲜组织，液氮冻存，称取80 g PTC组织和正常甲状腺组织，Trizol试剂盒（Life Technologies，美国）提取组织中总RNA，测定RNA纯度和浓度。取1 μg RNA 经miRNA First Strand Synthesis Kit试剂盒（大连宝生物工程有限公司，中国）逆转录成cDNA。采用SYBR green染料法，内参基因U6，经miR-X miRNA qRT-PCR TB Green Kit试剂盒（大连宝生物工程有限公司）定量检测miR-221-3p表达水平，每例样本均设置3 个复孔。反应条件：95 ℃预变性10 s，95 ℃ qRT-PCR 5 s，60 ℃延伸20 s，共40 个循环。采用2-△△Ct法计算miR-221-3p相对表达水平。引物序列由上海生工生物有限公司合成（表1）。

表1 引物序列

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 PTC 组织与正常甲状腺组织CK 19 表达情况

本研究中，26 例PTC组织及23 例正常甲状腺组织均行术中冰冻免疫组织化学染色，所选免疫标记为CK19，26 例PTC组织CK19 表达均为阳性，23 例正常甲状腺组织CK19 表达均为阴性（图1）。

图1 CK19 在PTC组织和正常甲状腺组织中的表达情况

2.2 PTC 组织与正常甲状腺组织中miR-221-3p 相对表达量比较

PTC组织中miR-221-3p相对表达量高于正常甲状腺组织（P＜0.05）（表2）。

表2 PTC组织与正常甲状腺组织中miR-221-3p相对表达量比较

2.3 不同临床病理特征PTC 患者miR-221-3p 表达水平比较

比较不同性别、年龄、肿瘤直径和肿瘤病灶数的PTC患者miRNA-221-3p表达水平，差异无统计学意义（P＞0.05）；淋巴结转移的PTC患者肿瘤组织中miR-221-3p 表达水平高于无淋巴结转移PTC患者（P＜0.05）（表3）。

表3 不同临床病理特征PTC患者miR-221-3p表达水平比较

2.4 PTC 患者淋巴结转移危险因素分析

多因素Logistic回归分析，采用向前似然比法，引入变量标准为α入=0.05，剔除标准为α出=0.10。以PTC患者淋巴结转移情况为因变量，结果显示，miR-221-3p自变量的OR值22.761，说明PTC患者发生淋巴结转移中miR-221-3p高表达优势比是低表达的22.761 倍，为危险因素；病灶数目和年龄虽优势比OR＞1，但阳性结果发生的条件概率差异无统计学意义（P＞0.05），这可能因病例样本量偏少引起。由此可见，miR-221-3p高表达为PTC患者发生淋巴结转移的主要危险因素（表4）。

表4 PTC患者淋巴结转移危险因素分析

3 讨论

PTC是一种起源于甲状腺滤泡细胞的恶性肿瘤，近年来发病率持续增高，女性发病率远高于男性，且在疾病早期约有10%～15%的患者可以发生远处转移[7]。是否发生淋巴结转移是PTC手术治疗及预后的重要判断依据之一。虽然现代超声影像技术、细胞病理技术高度发展，但超声TI-RADS分级诊断系统对4 级以上结节的恶性可能性评估范围跨度较大（5%～100%）[8]，细针穿刺细胞活检也依然存在因大小、部位、距体表距离而造成淋巴结转移证据漏诊或不精准的情况[9]。所以，寻找新型分子标志物用于诊断、术前评估和预后治疗显得尤为重要。术中冰冻免疫组织化学染色技术应用于术中冰冻肿瘤标本，基于抗原抗体相结合的原理而出现快速高效的染色方法，已经成为病理辅助诊断较为常用的染色方式，再结合苏木素-伊红染色可大大提高病理学对肿瘤性质、类型、来源等快速诊断的能力[10-11]。CK19 是上皮细胞分泌的一种糖蛋白，分子量为40 kDa，免疫组织化学染色中主要用来标记单层上皮，在鉴别甲状腺各种肿瘤类型方面具有较高的灵敏度和特异性[12-15]，尤其是结合苏木素-伊红染色技术后对PTC诊断更为精准，为本研究选择术中免疫组织化学染色抗体提供了理论依据。

miRNAs是一种长度约为22 个核苷酸、无蛋白编码能力的调节分子，其介导的调控是真核生物中最广泛的转录后调控机制之一，可能调控超过30%的哺乳动物基因产物，参与了细胞增殖、分化、凋亡甚至器官形成等重要生命活动[16-17]。miR-221-3p 编码基因位于Xp11.3 染色体，并且在宫颈癌、肝癌、结肠癌、鼻咽癌等多种恶性肿瘤中异常上调表达[18-20]。本研究发现，PTC组织中miR-221-3p表达高于正常甲状腺组织，提示PTC患者miR-221-3p高表达，进一步纳入临床病例特征，通过Logistic多因素分析得出，miR-221-3p高表达为PTC患者发生淋巴结转移的独立危险因素。

综上所述，本研究根据PTC具有发病率高、早期易出现远处转移的特点，采用术中冰冻诊断结合冰冻免疫组织化学染色的方法，极大提高了术中诊断PTC的准确性，避免患者因诊断不清再次手术所带来的创伤。术后通过分子生物学方法检测确定了PTC转移的独立危险因素，对患者的预后评估及治疗均提供了有效的检测手段。