连云港市新型冠状病毒感染者恢复期中和抗体和部分生化指标分析

朱晓露,徐梦蝶,李海朋,卞光玲,路静,王一力,赵兴

1.连云港市疾病预防控制中心,江苏 连云港 222000;2.连云港市海州区疾病预防控制中心

新型冠状病毒感染为新发传染病,恢复后可引发系列后遗症,如嗅觉障碍、Ⅱ型糖尿病[1]、肾脏疾病[2]、心力衰竭和中风[3]等。感染者恢复后身体状况的持续监测,对更好地理解新冠病毒感染的致病程度具有重要的价值。本研究通过对感染者恢复期1.5年内的血清随访检测结果进行分析,通过观察感染者中和抗体和部分生化指标的动态变化趋势,探究新冠病毒感染后的机体恢复情况,为更好地研究新冠病毒感染后人群的恢复状况提供实验室数据。

1 材料和方法

1.1 对象 2020年1—3月连云港市本地新冠病毒感染者82例,在知情同意的情况下,对56例恢复期感染者进行采样召集,分别在2020年8月、2021年4月、2021年10月进行恢复期0.5、1、1.5年的咽拭子和血清采集,共125份,其中3份血清均完整采集25例。以此25例为本研究对象。本研究通过伦理学审查。

1.2 主要仪器与试剂 仪器: QuantStudio 7 Pro荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystens),全自动核酸提取仪(江苏硕世),酶标仪(安图),洗板机(赛默飞世尔),医用离心机(新时代北利医疗)。试剂:人总蛋白试剂盒(ELISA法,研科生物),人D-二聚体试剂盒(ELISA法,研科生物),人降钙素原试剂盒(ELISA法,研科生物),人C-反应蛋白试剂盒(ELISA法,研科生物),新冠病毒中和抗体检测试剂盒(ELISA法,上海捷诺生物),新冠检测试剂(荧光PCR法,上海伯杰),核酸提取试剂(磁珠法,江苏硕世),所有试剂均在效期内使用。

1.3 方法

1.3.1 核酸检测 样本核酸提取依据硕世试剂说明书进行,采用样本核酸5 μL。采用新冠病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法,上海伯杰)在QuantStudio 7 Pro荧光定量PCR仪上检测新冠病毒(N基因,ORF1ab基因);循环参数设定:50℃逆转录10 min;95℃预变性5 min;95℃变性10 s,55℃延伸40 s,45个循环。每次循环55℃荧光检测,检测通道FAM(ORF1ab),VIC(N基因),ROX(内参),淬灭基团None。

1.3.2 人总蛋白和部分生化检测 ①从室温平衡20 min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余半条用自封袋密封放回4℃。②设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL,样本孔加入待测样本50 μL,空白孔不加;③除空白孔外,标准品孔和样本孔中各加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100 μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅温育60 min;④使用洗板机进行洗板,弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(350 μL),静置1 min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次。⑤每孔加入底物A、B各50 μL,37℃避光孵育15 min;⑥每孔加入终止液50 μL,15 min内在450 nm波长处测定各孔的OD值。

1.3.3 中和抗体检测 ①质控品、标准品及样本加样:将准备好的质控品、校准品和样本,按照顺序依次加入微孔板A中,每孔加入20 μL。之后加入100 μL RBD蛋白并混匀,用膜封闭微孔反应板A置于37℃微孔板恒温振荡器孵育30 min。②与ACE2反应:于混合均匀的微孔反应板A中吸取100 μL的混合物,加入微孔反应板B中,封膜后置于37℃恒温振荡器孵育1 h。③洗板:甩尽微孔反应板B中的液体,洗涤液注满各孔,约加入350 μL洗涤液静置10 s,甩尽孔里的液体,在吸水纸上拍干,以上步骤反复5次。④酶标抗体:微孔反应板B每孔加入100 μL酶标抗体,封膜后于37℃微孔板恒温振荡器孵育30 min。⑤洗板:步骤同③。⑥显色:每孔加入100 μL底物,封膜后于37℃微孔板恒温振荡器避光孵育15 min。⑦终止:每孔加入100 μL终止液,15 min内完成读数。⑧测定OD值:用酶标仪读数,测量波长450 nm,读取各孔OD值。

1.4 质量控制 SARS-Cov-2严格按照《新型冠状病毒肺炎防控方案(第七版)》执行,做好三阴一弱阳对照、试剂阴阳性对照。结果判定依据:阴性对照FAM通道、VIC通道无Ct值;阳性对照(FAM、VIC、ROX通道)Ct≤30。阳性,样本检测Ct值≤40,曲线呈S型且明显指数增长;阴性,样本检测Ct值>40或无Ct值;可疑,Ct值≤40,需重复检测,若Ct值仍≤40,判为阳性,否则为阴性。

SARS-Cov-2人总蛋白和部分生化结果判定:以所测标准品OD值为横坐标,标准品的浓度值为纵坐标,绘制标准曲线得直线回归方程,将样本的OD值带入方程,计算出样本的浓度。

SARS-Cov-2中和抗体检测:使用校准品浓度(X轴)相对于校准品1-6的吸光度值(Y轴)绘制标准曲线。拟合方法是四参数Logistic函数,将样本的OD值带入方程,计算出样本的浓度。中和抗体<6.25 IU/mL则报告为<6.25 IU/mL;中和抗体>100 IU/mL则需要使用稀释液稀释后重新测定。

1.5 统计分析 采用Excel 2007整理数据,SPSS 19.0软件统计分析,计量资料采用方差分析(两两检验采用配对设计的t检验),中和抗体滴度数值取对数值进行分析,检验水准:α=0.05。

2 结果

2.1 基本情况 25名新冠病毒感染者,男8例,女17例,职业为离退人员9例、家务及待业8例、干部职员4例、教师或工人2例、其他2例;感染毒株均为新冠病毒原始株,年龄最大75岁,最低23岁,中位数为52岁;确诊病例13例,无症状感染者12例;确诊病例(轻型和普通型)平均住院(23.54±5.53)d,无症状感染者为(16.83±8.33)d,差异有统计学意义(t=2.35,P<0.05)。所有病例均顺利出院,出院后至监测结束均无疫苗接种史。

2.2 核酸随访结果 25例新冠病毒感染者恢复期3次咽拭子标本采集,经检测SARS-Cov-2核酸均为阴性。

2.3 中和抗体变化情况 25例感染者恢复期0.5、1、1.5年,新冠病毒中和抗体滴度分别为(2.05±0.57)、(1.98±0.61)、(2.40±0.53) IU/mL,差异有统计学意义(F=3.73,P<0.05);其中恢复期1.5年中和抗体滴度最高,恢复期0.5年其次,恢复期1年最低,两两比较差异均有统计学意义(t0.5～1.5年=4.43,t0.5～1年=2.85,t1～1.5年=5.48,P值均<0.05)。按照疾病程度划分,3个时间段的平均中和抗体滴度,确诊病例组(2.28±0.58)IU/mL高于无症状感染者组(1.99±0.57)IU/mL,差异有统计学意义(t=72.65,P<0.05)。

2.4 人总蛋白和部分生化指标变化情况 检测的人总蛋白、人C-反应蛋白、D-二聚体、人降钙素原,在恢复期0.5、1年、1.5年其浓度差异均有统计学意义(F=73.20、42.73、42.39、56.21,P值均<0.05)。见表1。

表1 25名新冠病毒感染者不同恢复期部分生化指标检测结果

两两比较,人总蛋白恢复期0.5年高于恢复期1年、恢复期1.5年,差异均有统计学意义(t=11.58、9.73,P值均<0.05),恢复期1年与恢复期1.5年间差异无统计学意义(t=0.31,P>0.05);人C-反应蛋白恢复期1年低于恢复期0.5年、恢复期1.5年,差异均有统计学意义(t=14.55、9.53,P值均 <0.05),恢复期0.5年和恢复期1.5年差异无统计学意义(t=1.65,P>0.05);D-二聚体恢复期1年低于恢复期0.5年、恢复期1.5年,差异均有统计学意义(t=9.85、12.65,P值均<0.05),恢复期0.5年和恢复期1.5年间差异无统计学意义(t=0.47,P>0.05);人降钙素原恢复期1.5年高于恢复期0.5年、恢复期1年,差异均有统计学意义(t=2.22、13.182,P值均<0.05);恢复期0.5年高于恢复期1年(t=11.52,P<0.05)。

3 讨论

本研究对新冠病毒感染者进行了1.5年随访,3次咽拭子核酸检测结果均为阴性,此项监测指标是为了有助于复阳病例的早发现,也避免了因项目的开展增加高风险人群聚集传播的风险。在3个监测时间点,中和抗体滴度存在明显差异,恢复期0.5年、恢复期1.5年均高于恢复期1年,其产生的原因是否是因为IgM、IgG抗体波动变化导致尚不得而知,仍需深入随访探究IgM、IgG的定量动态变化以及中和抗体的长期含量波动水平。

研究表明,新冠病毒感染者重症患者中,多数出现C反应蛋白(CRP)[4-5]和血清乳酸脱氢酶(LDH)升高,部分白蛋白( ALB)降低,降钙素原正常,提示上述指标在病程判断、预后判断中可能的参考指标作用[6]。C反应蛋白升高是稳定的病毒性感染指标之一,常用于病毒感染的判定和机体抗病毒治疗恢复的标识,作为体内炎症标记物,在新冠病毒感染者或部分新冠药物治疗的副反应中均有出现[7]。开展的新冠感染者发病期、恢复期和健康人群的对照研究中发现,前两者的血清蛋白组学发生了显著性改变[8],但具体改变的蛋白种类尚不明确。本研究针对新冠病毒感染者的1.5年随访监测中,感染者的总蛋白、C-反应蛋白、D-二聚体、人降钙素原4个指标在不同恢复期均存在变化,其恢复水平与正常人群的生化指标学差异尚不能明确,且各指标在恢复期中发挥的作用尚未可知,仍需持续的监测,探明感染者恢复到正常水平所需的时间及其具体作用。

我市新冠病毒原始株感染者恢复期1.5年内的中和抗体水平和生化指标动态监测结果表明,中和抗体水平和总蛋白、C-反应蛋白、D-二聚体、人降钙素原等生化指标,在不同恢复期随访中均存在变化,感染者的预后评估尚需要持续、深入地追踪。