Xpert MTB/RIF与结核分枝杆菌利福平耐药表型检测一致性分析

茹浩浩 陈连勇 杨 星 陈 涛 闫双群 许 琳

（云南省疾病预防控制中心结核病防治所，云南 昆明 650022）

Xpert MTB/RIF是一种检测结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）及其利福平（rifampicin，RFP）耐药性的半巢式实时荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测技术。这一技术是针对rpoB基因81 bp的利福平耐药决定区（rifampicin resistance determining region，RRDR）设计引物和探针，检测其是否发生突变，进而诊断患者是否感染MTB，以及是否对RFP耐药[1]。有研究发现，Xpert MTB/RIF检测RFP耐药性具有较高的敏感性和特异性，与表型药物敏感性试验（phenotypic drug susceptibility test，pDST）结果有较好的一致性，但也存在耐药结果不一致的情况[2]。异质性耐药，即分离自患者样本的菌株中，既有敏感株，又有耐药株，是导致表型和基因型耐药检测结果不一致的主要原因[3]，全基因组测序（whole genome sequencing，WGS）可以发现这种异质性耐药[4]。为了了解Xpert MTB/RIF检测RFP耐药性和pDST结果的一致性，并分析2种方法检测结果不一致的原因，本研究对2020年云南省耐药监测中行Xpert MTB/RIF检测的672株MTB进行比例法pDST。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2020年云南省耐药监测中行Xpert MTB/RIF检测的672株MTB。Xpert MTB/RIF检测由云南省耐药监测点实验室完成，并将结果汇报至云南省疾病预防控制中心结核病参比实验室。收集患者基本信息和相关实验室检测结果。

1.2 仪器和试剂

改良中性罗氏培养基、含药罗氏培养基购自珠海贝索生物技术有限公司。RFP药物培养基内药物终浓度为40 μg/mL。

1.3 方法

1.3.1 菌种鉴定和药物敏感性试验

采用比例法进行pDST。以MTB标准株（H37Rv）作为敏感对照，标准株由中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室提供。

1.3.2 测序

菌株灭活后，委托上海晶诺生物科技有限公司提取DNA并进行测序，测序平台为美国Illumina公司Illumina二代测序平台，双端测序，测序平均深度100×以上。

1.3.3 WGS数据分析

用TB-profiler V4.0.3（https：//github.com/jodyphelan/TBProfiler/）分析测序Fastq原始数据，获得菌株的耐药基因突变特征。采用Trimmomatic软件进行质控（去除接头、引物序列、低质量序列），以H37Rv标准菌株为参考序列，用BWA和Samtools软件进行比对和排序，GATK4软件标记PCR重复，获得bam文件，导入IGV V2.12软件，参照H37Rv标准菌株序列，查看是否存在异质性耐药的情况[5-6]。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0软件进行统计分析。计数资料以例或率表示。以pDST结果为金标准，采用四格表分析Xpert MTB/RIF检测RFP耐药的敏感性和特异性。

2 结果

2.1 Xpert MTB/RIF与pDST结果的一致性

672株MTB中，有36株pDST结果为RFP耐药，其中Xpert MTB/RIF耐药34株、敏感2株。636株pDST结果为RFP敏感菌株中，Xpert MTB/RIF耐药17株、敏感619株。672株MTB中，有594株分离自初治患者，78株分离自复治患者。以pDST结果为标准，672株MTB的RFP耐药率为5.36%；初治患者菌株耐药率为3.87%（23/594），复治患者菌株耐药率为16.67%（13/78），Xpert MTB/RIF检测RFP耐药性的敏感性为94.44%、特异性为97.32%、阳性预测值为66.67%、阴性预测值为99.52%。Xpert MTB/RIF检测初治患者RFP耐药的敏感性为95.65%、特异性为98.25%；Xpert MTB/RIF检测复治患者RFP耐药的敏感性为92.31%，特异性为89.23%。见表1。

表1 初治和复治患者Xpert MTB/RIF与pDST结果一致性 例

2.2 Xpert MTB/RIF与pDST不一致结果WGS分析

672株MTB中，有19株（2.83%）Xpert MTB/RIF与pDST结果不一致。2株Xpert MTB/RIF显示RFP敏感，pDST显示耐药菌株中，有1株未检出耐药突变，1株检出rpoB-Ile491Phe突变；17株Xpert MTB/RIF显示RFP耐药，pDST显示敏感的菌株中，检出rpoB-Leu452Pro突变、rpoB-Ser450Leu突变各4株，rpoB-Leu430Pro突变3株，rpoB-His445Asn突变2株，rpoBAsp435Tyr突变、rpoB-His445Asp突变、rpoBHis445Ser突变和rpoB-Ser450Trp突变各1株。共18株MTB发生RFP耐药相关突变，在突变位点完全纯合的MTB有6株，其余12株均有1～3个短序列（reads）为野生型（即未发生突变），未发生突变的reads所占比例最高[1.56%（3/192）]。1株未检出RFP耐药相关突变的MTB，在rpoB基因RRDR区也未发现明显的异质性耐药。另外，18株WGS检出RFP耐药相关突变的菌株中，有10株同时检出其他药物耐药相关突变：包括氟喹诺酮耐药相关gyrA基因突变4株，异烟肼耐药相关ahpC、fabG1、katG基因突变5株，阿米卡星耐药相关rrs-1401A＞G突变1株；其他8株仅发生RFP耐药相关突变（rpoB-452位点突变3株，rpoB-450位点突变3株，rpoB-445位点突变1株，rpoB-430位点突变1株）。部分（2株）rpo-450突变菌株突变位点可视化图见图1。

图1 部分（2株）rpoB-450突变菌株突变位点可视化图

3 讨论

本研究中，Xpert MTB/RIF与pDST检测RFP耐药结果有较好的一致性。以pDST结果为标准，Xpert MTB/RIF检测RFP耐药有较高的敏感性和特异性，在初治患者和复治患者中敏感性均较高，在复治患者中的特异性稍低于初治患者，与其他研究结果[7-8]一致，提示无论对于初治患者，还是对于复治患者，Xpert MTB/RIF检测RFP耐药均有较好的效能。

本研究中，2株Xpert MTB/RIF显示RFP敏感、pDST显示耐药的MTB中，WGS未检出耐药突变1株，提示可能存在已知RFP耐药突变以外的其他类突变或外排泵机制；另外，有1株为rpoB-Ile491Phe突变，该突变位于RRDR外，属于罕见突变，因在Xpert MTB/RIF检测靶点范围外，故未被检测到。17株Xpert MTB/RIF显示RFP耐药、pDST显示敏感的MTB中，WGS均检出RFP耐药相关的rpoB基因突变，其中rpoBLeu452Pro突变4株、rpoB-Leu430Pro突变3株。王希江等[9]发现，rpoB-452位点突变对应低浓度耐药，不建议将rpoB-Leu430Pro突变列为RFP耐药相关突变。本研究有10株MTB虽然发生rpoB-Ser450Leu等RFP中、高浓度耐药突变[9]，但pDST结果依然为RFP敏感，原因可能为：1）pDST虽然是药物敏感性试验的金标准，但比例法pDST为手工操作，受操作者、试剂、环境等因素的影响，结果可能存在一定误差；2）异质性耐药。本研究有18株检出RFP耐药相关突变的MTB中，突变位点完全纯合的有6株，其余12株中均未发生突变的reads所占比例最高[1.56%（3/192）]，提示这些菌株中虽然普遍存在较低的异质性，但发生RFP耐药相关突变菌群的比例远大于敏感菌群，而比例法pDST理论上可以检测出耐药亚群比例≥1%的耐药菌[4]。这些菌株虽然发生了rpoB-Ser450Leu等中、高水平耐药突变，但pDST结果依然为RFP敏感的主要原因可能是pDST的不稳定性，而不是异质性耐药。

综合以上结果，Xpert MTB/RIF与pDST检测RFP耐药结果不一致时，除Probe A探针突变外（包含rpoB-430位点），只要其中1种方法显示RFP耐药，均应视为耐药。根据这个原则，结合WGS结果综合判断，本研究中可判定RFP耐药的MTB为50株，据此判断，Xpert MTB/RIF检测RFP耐药性的敏感性为96.00%、特异性为99.52%，阳性预测值为94.12%，阴性预测值为99.68%。与本研究类似，国外也有研究证实Xpert MTB/RIF与基因测序检测RFP耐药结果的一致性高于pDST，Xpert MTB/RIF与pDST中RFP耐药结果不一致的样本通过参考基因测序结果进行校正后，敏感性和特异性也有一定的提升[8]。既往研究中，因为在低RFP耐药率患者中较低的阳性预测值，往往认为Xpert MTB/RIF应优先用于RFP耐药率较高的定点医院，以及耐多药高危人群[2]。本研究药物敏感性以综合判定结果为金标准，校正Xpert MTB/RIF检测RFP耐药性的阳性预测值为94.12%，这说明在RFP耐药率较低的人群中，Xpert MTB/RIF检测获得的RFP耐药结果比较可靠。同时，根据综合判断，RFP耐药率为7.44%（50/672），比仅依靠pDST的RFP耐药率[5.36%（36/672）]提高了2.08%。既往云南省耐药监测主要参考pDST结果，所以RFP耐药率可能在一定程度上被低估。全国范围的大样本量的数据也证实WGS检测到的几乎所有药物的耐药率都高于pDST[10]，而既往云南省耐药监测中RFP耐药率为6.38%～8.71%，耐多药率为3.78%～7.46%[11-13]，根据2016年的数据[12]，推测云南省实际的R F P 耐药率约为8.00%，提示未来有必要将WGS应用到耐药监测中，以提高结果的准确性。

此外，本研究17株Xpert MTB/RIF显示RFP耐药而pDST显示RFP敏感的菌株中，有8株仅发生RFP耐药相关突变（rpoB-452位点突变3株，rpoB-450位点突变3株，rpoB-445位点突变1株，rpoB-430位点突变1株），占47.06%。提示有可能合并发生了其他药物耐药相关突变菌株的RFP耐药水平要高于仅发生RFP耐药相关突变的菌株，这需要后续研究通过最低抑菌浓度法药物敏感性试验和WGS相结合来进行验证。