基于荧光素酰肼的次氯酸根荧光探针的开发及其在有效氯测定中的应用

侯效佳，任楚旋，李 燕

（1.山西师范大学 化学与材料科学学院，山西 太原 030031；2.长治学院 化学系，山西 长治 046011）

随着“后疫情时代”到来，我们的生活逐渐回归正常，但疫情已经重塑了人们对健康的观念和生活习惯，同时，人们对居家生活以及公共环境的消杀防疫提出了更高的要求。

次氯酸盐作为活性氧（ROS）的一种，在日常生活中得到了广泛的应用，如饮用水的消毒、冷却水处理、家用漂白剂、抗菌剂等。然而，HClO 的使用浓度需要维持在10-5-10-2mol/L，过高或者过低的次氯酸浓度都会对人类健康造成影响。次氯酸（HClO）/次氯酸盐（ClO-）在对微生物的免疫防御和免疫过程中起着关键作用［1］，具有重要的抗菌性能［2］。在生物体中，次氯酸与杀灭多种病原体的先天宿主防御有关［3］，它主要由过氧化氢和氯离子在血红素酶髓过氧化物酶（MPO）参与的反应中产生［4］。人们生活中使用的自来水主要通过活性氯杀菌以保证饮用安全，余氯含量过少会导致细菌滋生影响健康，余氯过高会影响饮用水口感，同时对人体健康造成一定的伤害。世卫组织规定饮用水余氯浓度低于5 mg/L，而我国《生活饮用水卫生标准》［5］也规定，出厂的自来水的余氯含量应该保持在0.3～2 mg/L之间，而家庭末端余氯含量不得小于0.05 mg/L，这样才能保证在整个管线运输过程中完全、彻底且持续的杀菌消毒，以保证用水的安全。因此开发一种具简便、快捷且高灵敏度的有效氯检测方法，对于后疫情时代背景下的消杀防疫以及用水安全都极为重要。

与液相色谱-质谱（LC-MS）、电位法、离子色谱、电分析和化学发光等传统技术相比，荧光分析技术因其良好的时空分辨率、优异的灵敏度和特异性以及操作方便、快速响应和原位可视化而受到越来越多的关注［6，7］。迄今为止，已有诸多课题组开发出各种原理和报告基团的荧光探针［8-11］用于生命体系次氯酸根的检测，但是高灵敏度、能直接用于消杀防疫以及家庭用水余氯含量检测的有效氯探针还少有报道。

文章以荧光素为报告基团，以吡啶二甲酸为桥，设计并合成了一种能够快速检测市售含氯消杀产品以及自来水管网余氯含量的有效氯荧光探针D-FL-Cl。通过吡啶二甲酸将两个荧光素酰肼桥联，在提高检测灵敏度的同时，进一步提高了探针响应的可靠性。通过荧光光谱对有效氯含量监测能力进行了考察，并进一步探索了其在日用含氯消杀产品以及自来水余氯含量监测中的应用。

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

主要仪器：Esquire 3000 plus 电喷雾离子阱质谱仪（美国，布鲁克·道尔顿公司）；Bruker Advance-400 型核磁仪（美国，布鲁克·道尔顿公司）；F-4600 荧光光度计（日立，Hitachi F-4600）。

主要试剂：荧光素购自于安耐吉公司；吡啶二甲酰氯购自梯希爱公司（上海），水合肼以及合成所用溶剂及常见原料药品均购自于国药集团化学试剂有限公司；分析测试试剂选用分析纯（A.R.），合成及分析实验如未特别注释，均在室温下进行。

1.2 探针D-FL-Cl 合成

探针D-FL-Cl 的合成路线如图1 所示。

图1 探针D-FL-Cl 合成路线

1.2.1 荧光素肼的合成

将荧光素（3.320 g，10 mmol）溶于50 mL乙醇中，用恒压滴液漏斗逐滴加入含有6 mL 水合肼的无水乙醇溶液（15 mL），30 min 内滴加完毕，回流过夜至溶液荧光消失，颜色变为无色。将反应液冷却至室温，加入到500 mL 冰水中，产生乳白色沉淀，抽滤，用水洗涤，干燥，得到白色固体（2.95 g，产率：85%）。产物无需纯化，进行下一步反应。

1.2.2 D-FL-Cl 的合成

将荧光素肼（766 mg，2.2 mmol）和三乙胺（400 mg，4 mmol）溶于10 mL 无水乙腈中，置于50 mL 圆底烧瓶中，冰浴下用恒压滴液漏斗逐滴加入溶有吡啶二甲酰氯（204 mg，1 mmol）的无水乙腈溶液，滴加完毕恢复至室温，搅拌过夜，旋蒸，柱色谱纯化（V二氯甲烷∶V甲醇=20 ∶1），得到D-FL-Cl 无色白色粉末（约650 mg，产率：79%）。1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ 10.57（s，2 H），9.80（s，5 H），8.05（dd，J=8.5，7.0 Hz，1 H），7.92（dd，J=15.4，7.5 Hz，4 H），7.71-7.55（m，4 H），7.10（d，J=7.5 Hz，2 H），6.62（d，J=8.7 Hz，4 H），6.51（d，J=2.4 Hz，4 H），6.49（s，1 H）。

2 结果与讨论

2.1 探针D-FL-Cl 对次氯酸ClO-的检测性能

2.1.1 探针D-FL-Cl 对次氯酸ClO-的荧光响应

文章首先研究了探针D-FL-Cl 与ClO-在PB缓冲液（pH=7.4，10 mmol/L）中的荧光光谱响应情况。如图2a 所示，在PB 缓冲液中，探针表现出非常微弱的荧光，随着ClO-的不断加入，体系在516 nm 处的荧光逐渐增强，当体系中ClO-的浓度增加到30 μmol/L 时，体系的荧光强度增强了约212 倍，表现出超高的灵敏度。这缘于ClO-的存在使荧光素发生开环反应进而释放出荧光素的荧光。由图2b 可知，荧光强度与ClO-的浓度在0～15 μmol/L 范围内表现出非常好的线性关系（R2=0.9960）。

图2 a）探针D-FL-Cl（5 μmol/L）对PB（pH=7.4，10 mmol/L）中不同浓度ClO-（0～30 μmol/L）的荧光滴定光谱；b）反应体系在516 nm 处的荧光强度与ClO-浓度的关系

2.1.2 选择性研究

为了考察探针D-FL-Cl 对ClO-的选择性，在平行条件下考察了不同的阴离子、阳离子和氨基酸等在探针溶液中的响应情况（图3）。所有的阴、阳离子和氨基酸的浓度均为100 μmol/L，与之对照的ClO-的浓度为30 μmol/L。

图3 探针D-FL-Cl（5 μmol/L）对PB（pH=7.4,10 mmol/L）中100 μmol/L 阴离子（a）、阳离子（b）、氨基酸（c）的荧光（516 nm 处）响应

由图3 可知，这些常见的分析物质均未能引起探针分子荧光的恢复，D-FL-Cl 对ClO-表现出较好的选择性。

2.1.3 荧光响应机制

根据探针对次氯酸根的光谱响应情况及参考相关文献［12，13］，D-FL-Cl 对ClO-可能的响应机制如图4 所示，HClO 可将荧光素基吡啶二甲酰肼氧化为吡啶二甲酰亚胺，进而导致荧光素螺环开环，荧光得以恢复。同时，体系在水溶液中进一步发生水解而释放出荧光素分子，实现探针体系对ClO-的荧光OFF-ON 响应。

图4 探针D-FL-Cl 对ClO-的响应机制

2.2 探针D-FL-Cl 对84 消毒液有效氯评估

后疫情时代，含活性氯的消杀产品为家庭及公共健康安全提供了强有力的保障。有效氯的含量是该类产品杀菌消毒的关键，一种快速评估活性氯浓度的检测方法至关重要。为了评估探针在后疫情时代消杀防疫领域应用的可行性，文章选择了家庭消杀最常用的市场化商品84 消毒液作为测试对象，并将其浓度稀释20、200 和1000 倍。图5-1 和图5-2 分别显示了自然光以及荧光灯下探针D-FL-Cl 对不同稀释倍数的84 消毒液进行活性氯检测，并与1 mol/L H2O2溶液和空白（蒸馏水）对比。84 消毒液正常使用浓度为产品原液稀释20 倍，结果表明，探针对稀释1000 倍的产品仍表现出较强的荧光响应，探针的灵敏度足以满足日常消杀产品评估的需求。且H2O2等其他类型的氧化剂不能引起荧光响应，不会对有效氯的含量监测评估造成影响。

图5 探针D-FL-Cl 在1）自然光、2）荧光下对不同稀释倍数的84 消毒液进行活性氯检测（a：84消毒液稀释20 倍，有效氯含量0.4～1.025 mg/mL；b：稀释200 倍，有效氯含量0.04～0.1025 mg/mL；c：稀释1000 倍，有效氯含量0.008～0.0205 mg/mL；d：1 mol/L H2O2 溶液；e：空白）

考虑到使用时的便携性，文章将探针负载于Al2O3粉末上，对不同稀释倍数（20、200、1000和2000 倍）的84 消毒液进行了检测，并与1 mol/L H2O2溶液和空白（蒸馏水）对比，结果如图6。图6 表明，固相负载的探针对稀释2000 倍的产品仍表现出较强的荧光响应，显示了超高的灵敏度，能够满足日用消杀产品活性氯检测要求。同样，H2O2不能引起荧光响应。

图6 探针D-FL-Cl 负载于Al2O3 粉末上对不同稀释倍数的84 消毒液进行活性氯检测（a：空白；b：1 mol/L H2O2 溶液；c：84 消毒液稀释20 倍，有效氯含量0.4～1.025 mg/mL；d：稀释200 倍，有效氯含量0.04～0.1025 mg/mL；e：稀释1000 倍，有效氯含量0.008～ 0.0205 mg/mL；f：稀释2000 倍，有效氯含量0.004～0.01025 mg/mL）

2.3 探针D-FL-Cl 对各种饮用水中余氯含量检测

相较于消杀产品，日常自来水的饮用安全更是直接关系我们的健康。我国居民家用自来水净化方式采用的是氯气杀菌的方法。家庭用水余氯含量控制在一定范围内极为重要。过少的余氯意味着自来水出厂及运输过程中有效氯浓度不够，容易导致水中细菌等滋生，净化不彻底。而过高的余氯含量会直接影响到人体健康。文章通过所设计合成的探针D-FL-Cl 对自来水、井水以及蒸馏水进行了余氯检测（图7）。由图7 可知，b 管中荧光较强，可知自来水中相较于井水与蒸馏水余氯含量更高。结果表明，探针对自来水中的余氯含量表现出超高的灵敏度，可以用来指导自来水输送过程中及管网末端余氯含量的监测。

图7 探针D-FL-Cl 用于自来水余氯检测

3 结论

综上所述，文章设计并合成了一种基于双酰肼荧光素的吡啶二甲酸桥接荧光探针（D-FL-Cl）用于活性氯检测。该探针对ClO-具有较高灵敏度，可以用于裸眼识别ClO-，同时该探针对活性氯表现出较好的选择性。该探针可以应用于日常生活中对84 消毒液等活性杀菌剂活性氯的有效评估，也可以实现自来水中余氯含量的监测。