凝胶法与动态浊度法检测维生素B6注射液细菌内毒素

王超之，高新贞，王 丽，刘 枕，赵 锐*

（1.山东理工大学，山东 淄博 255000；2.淄博市食品药品检验研究院，山东 淄博 255086）

细菌内毒素是现今医药生产工业中最常见的外源性热原[1]，是革兰阴性菌细胞壁上的脂多糖结构，细菌增殖、死亡或溶解后内毒素从细胞壁表面释放，临床上可能导致严重的发炎和感染[2]。

维生素B6是人体内一些辅酶的组成成分，是维持人体健康所必须的营养物质，参与人体代谢过程和免疫调节，具有抗炎、抗癌等作用[3]。维生素B6注射液为无色或淡黄色的澄明液体，可用于预防和治疗小儿惊厥[4]；也能减轻妊娠呕吐或癌症治疗引起的恶心、呕吐等[5]，还可治疗长期或大量服用异烟肼导致的失眠、不安及周围神经炎[6]。其在酸性溶液中稳定，碱性溶液中易被破坏[7]。其现行标准收载于《中国药典》2020年版二部，细菌内毒素的限度为每1 mg维生素B6中含内毒素的量应小于0.30 EU[8]。国内文献多用凝胶限度法进行细菌内毒素检测[6,9-13]，未发现动态浊度法用于维生素B6注射液内毒素检测的文献。本研究根据《中国药典》2020年版四部通则1143和指导原则9251[14]，选择9个厂家共41批维生素B6注射液，分别用凝胶法和动态浊度法检测内毒素，并对比两种方法的结果。

1 仪器与材料

1.1 仪器

ZH-2型旋涡混合器（天津药典标准仪器厂）；TAL-40D型试管恒温仪（湛江安度斯生物有限公司）；PKF32细菌内毒素检测仪（美国ACC）。

1.2 试药

细菌内毒素工作标准品（中国食品药品检定研究院，批号：150601-202191，规格：90 EU/支）；动态浊度法鲎试剂（湛江安度斯生物有限公司，批号：2112290，可测内毒素范围：0.01～10 EU/ml，规格：每支1.25 ml）；鲎试剂（0.25 EU/ml，批号：2208053，湛江博康海洋生物有限公司；0.125 EU/ml，批号：2208023，湛江安度斯生物有限公司；0.125 EU/ml，批号：2204112，湛江博康海洋生物有限公司）；细菌内毒素检查用水（BET水，湛江安度斯生物有限公司，批号：2205171，规格：每支50 ml）；维生素B6注射液（华润双鹤利民药业，共7批，批号：21100320，22060205，22050319，22060204，21120307，21120305，21120306；瑞阳制药，共6批，批号：21060511，22030811，22030712，22030812，21101811，21101711；方明药业，共10批，批号：21091341，22021243，21091144，22051943，22052043，22051843，21090744，21091543，21091444，20091744；华鲁制药，共3批，批号：XA21I10，XA21I09，XA21I08；新华制药，共8批，批号：2204154，2204157，2204160，2009144，2201030，2112034，2201006，2112023；晋新双鹤药业，共2批，批号：220109221，220108221；太原药业，共2批，批号：211209，211214；欧意药业，共1批，批号：073210410；美大康华康药业，共2批，批号：22011317，22021627）。

2 方法与结果

2.1 凝胶法

2.1.1 干扰预试验 根据公式MVD=CL/λ（MVD：最大有效稀释倍数；C：供试品溶液的浓度；L：细菌内毒素的限值；λ：鲎试剂的标示灵敏度），不同灵敏度鲎试剂对应的样品MVD和最大不干扰浓度见表1。

表1 不同灵敏度鲎试剂MVD和最大不干扰浓度

取4个厂家各1批检品，用BET水溶解并稀释成0.883，0.417，0.208 mg/ml 3个浓度，作为供试品溶液（NPC）；另取相同批号检品，同样稀释为上述3个浓度，但稀释过程中加入内毒素标准品，使其含浓度为2λ（0.5 EU/ml）的细菌内毒素，作为供试品阳性对照溶液（PPC）。用λ为0.25 EU/ml的鲎试剂分别与上述溶液反应，每组做2个平行，同时设置阳性对照组（PC）和阴性对照组（NC），结果见表2。

表2 干扰预试验结果

由表2可知，当各厂家注射液稀释120倍及以上时可消除干扰。即应使用λ=0.125 EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂进行凝胶法细菌内毒素检查。

2.1.2 干扰试验 取表2的4批样品，根据中国药典2020年版四部通则1143进行干扰试验[4]，鲎试剂灵敏度λ=0.125 EU/ml，稀释剂为0.417 mg/ml样品溶液和BET水。结果见表3。结果表明，鲎试剂灵敏度的测定值（λc）在0.5λ和2λ之间，符合药典要求。

表4 标准曲线可靠性分析

2.1.3 供试品细菌内毒素限度检查 取9个厂家共41批检品，用灵敏度为0.125 EU/ml的鲎试剂依法进行检查，结果样品均符合规定。

2.2 动态浊度法

2.2.1 标准曲线的建立及可靠性分析 取1支细菌内毒素标准品，用BET水稀释，制成最终细菌内毒素浓度分别为1.25，0.25，0.05，0.01 EU/ml的标准溶液，精密量取上述标准溶液及BET水各 0.1 ml，分别加入预先加有0.1 ml动态浊度法鲎试剂的试管中，混匀，插入预热到37 ℃的PKF32细菌内毒素检测仪内进行自动检测，其中标准溶液重复3个平行，BET水重复2个平行。检测波长为660 nm。以平均反应时间的对数（lgT）为纵坐标，内毒素浓度的对数（lgC）为横坐标，绘制标准曲线。标准曲线回归方程为lgT=-0.3114lgC+2.794（r=-0.9966，绝对值大于0.980），平行管之间的RSD均小于10 %，阴性对照的反应时间大于标准曲线最低浓度的反应时间，细菌内毒素标准曲线成立。

2.2.2 干扰试验 供试品的最大稀释倍数MVD=CL/λ=50×0.3/0.01=1500倍。根据标准曲线内毒素浓度范围的设置，选择0.25 EU/ml作为靠近标准曲线中点的内毒素浓度（λm）。取3个厂家的各1批样品，用BET水将供试品分别稀释100，200，500倍，作为供试品溶液（NPC），同时另行制备含0.25 EU/ml内毒素的上述供试品溶液，作为供试品阳性对照溶液（PPC）；以BET 水作为阴性对照溶液（NC）。上述溶液均做2支平行管，并计算该试验条件下的回收率，结果见表5。由结果可知，样品稀释200倍回收率合格但偏低，稀释500倍回收率合格且更接近100 %，因此动态浊度法样品均稀释500倍进行检查。

表5 动态浊度法干扰试验结果

2.2.3 供试品细菌内毒素定量检查 用λ=0.01～10 EU/ml的鲎试剂进行试验，标曲范围为0.01～0.125 EU/ml，样品稀释倍数为500倍，结果41批检品细菌内毒素均小于0.01 EU/ml，符合标准规定。

3 讨论

3.1 鲎试剂灵敏度的选择

对于凝胶法检查维生素B6注射液细菌内毒素，以往研究者选择的鲎试剂灵敏度不尽相同，有的用0.06 EU/ml的鲎试剂[6,9,13]，有的用0.25 EU/ml的鲎试剂[10-12]，分析原因一是选择的供试品厂家不同，本研究也发现有的厂家用0.25 EU/ml的鲎试剂也能通过干扰试验；二是供试品生产年份不同，可能不同厂家、不同年份的产品存在工艺上的差别，导致干扰因素和干扰水平有差异。鲎试剂灵敏度太低可能无法消除试验干扰，灵敏度太高则增加了检验成本。本研究用0.125 EU/ml的鲎试剂即可通过干扰试验，也可节约试验成本。

3.2 稀释倍数的差别

进行内毒素检查时，供试品和鲎试剂混合后的溶液pH为6.0～8.0较为合适[14]。根据标准规定，维生素B6注射液pH应为2.5～4.0[8]，对内毒素检查造成干扰。本试验采用稀释的方法来消除pH的干扰作用。干扰试验表明，凝胶法稀释到120倍可去除干扰，动态浊度法稀释200倍回收率合格但偏低，稀释500倍回收率较好，与最大稀释倍数1500倍相比，稀释步骤较少。两种方法稀释倍数不同，文献中也常见这种情况，如丹红注射液凝胶法稀释倍数大[15]，痰热清注射液动态浊度法稀释倍数大[16]，因此，并不能完全参考凝胶法的稀释倍数直接进行动态浊度法试验。原因可能是由于两种方法的结果判定方式不同，凝胶法需要形成坚实、不变形的凝胶，动态浊度法则是检测反应混合物的吸光度达到设定值所需的时间[15]。

3.3 两种方法的比较

两种方法均可用于维生素B6注射液细菌内毒素检查。凝胶法操作简单，成本较低，是内毒素检查的经典方法和处理争议的仲裁方法，本试验中此方法稀释倍数比动态浊度法少，只能做限度检查。动态浊度法可获得更大的稀释倍数，灵敏度更高，能在一定浓度范围内定量检测细菌内毒素含量；建立标准曲线能更好地减轻内毒素标准品对试验准确性的影响，样品的受干扰程度可通过量化的回收率数值直观地表现出来，所用仪器设备能记录更多试验信息，数据完整性和可追溯性更好[17-18]。相关人员可根据需求选择合适的方法。