LC-MS测定二芳基吡唑类衍生物中的4-磺酰胺基苯肼和磺胺

2024-01-16 03:19王金虎
食品与药品 2023年6期
关键词:苯肼芳基吡唑

于 梦,孙 清,王金虎,孙 玲

(山东省药学科学院 山东省化学药物重点实验室,山东 济南 250101)

作为重要的中间体,吡唑类化合物广泛用于药物的合成和研制[1-3]。吡唑类化合物具有抗菌、消炎、抗肿瘤等多种药理活性[4-7],已有吡唑类化合物作为药物上市或进入临床研究,如抗炎药物塞来昔布、抗菌药物磺胺苯吡唑,抗高血压药物利奥西呱、抗癌药物蒽吡唑类等[8-10]。合成人员参考相关文献以选择性COX-2抑制剂塞来昔布为模型化合物,设计合成了多个二芳基取代的吡唑衍生物[11-13]。合成中间体4-磺酰胺基苯肼含遗传毒性警示结构,其起始物料磺胺有较大毒性且不易代谢[14-16],后续反应中会生成有遗传毒性警示结构的偶氮化合物。本文建立了采用液质联用技术测定二芳基吡唑类衍生物中4-磺酰胺基苯肼和磺胺的含量的方法[17-18],对两种杂质进行严格控制。杂质信息见表1。

表1 两种杂质信息

1 仪器与试药

1.1 仪器

UPLC-Q-Exactive Orbitrap液质联用系统(美国Thermo);XS205DU十万分之一分析天平(瑞士Mettler Toledo);Seven Excllence多参数测定仪(瑞士Mettler Toledo)。

1.2 试药

二芳基吡唑类衍生物(自制);4-磺酰胺基苯肼盐酸盐对照品(加拿大Toronto Research Chemicals,批号:1-QL-68-1,纯度:98 %);磺胺对照品(中国食品药品检定研究院,批号:100024-201103,纯度:99.2 %);甲醇(色谱纯,康科德);醋酸铵(分析纯,国药集团);醋酸(色谱纯,国药集团)。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 色谱条件 色谱柱:Inertsil Ph-3苯基柱(100 mm×4.6 mm,3 μm);流动相:0.01 mol/L醋酸铵缓冲溶液(pH 4.0)-甲醇,按表2进行梯度洗脱;流速:0.5 ml/min;柱温:25 ℃;进样量:5 μl;运行设置:切换阀控制5 min后流出液不再进入质谱检测器。

表2 梯度洗脱程序

2.1.2 质谱条件 离子源:加热电喷雾离子源(H-ESI);载气:氮气;离子传输管温度:320 ℃;辅助气加热温度:310 ℃;鞘气压力:35 psi;S-lens RF水平:50;辅助气压力:10 arb;喷雾电压:3.6 kV;扫描方式:选择离子监测,0~5 min:[M+Na]+m/z210.0,[M+Na]+m/z195.0,见图1。

图1 4-磺酰胺基苯肼(A)和磺胺(B)质谱图

图2 4-磺酰胺基苯肼(A)和磺胺(B)HPLC图谱

2.1.3 溶液的配制 对照品溶液的制备:取4-磺酰氨基苯肼和磺胺杂质对照品10 mg,精密称定,置100 ml量瓶中,用甲醇制成各自储备液。精密移取各对照品储备液1 ml,置100 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,制成混合对照品储备液。取混合对照品储备液适量,用甲醇逐步稀释制成每1 ml含4-磺酰胺基苯肼5 ng、磺胺5 ng的溶液,作为对照品溶液。

供试品溶液的制备:取二芳基吡唑类衍生物适量,精密称定,用甲醇溶液溶解并制成每1 ml中含2 mg的溶液,作为供试品溶液。

2.2 验证结果

2.2.1 专属性 取空白溶剂和对照品溶液,按2.1.1项下色谱条件进样分析,记录色谱图。结果表明4-磺酰胺基苯肼的保留时间为2.84 min,磺胺的保留时间为4.37 min,空白溶剂不干扰待测成分的测定。

2.2.2 溶液稳定性 取2.1.3项下对照品溶液,放置12 h,分别在0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 h进样测定。4-磺酰胺基苯肼峰面积的RSD为5.28 %,磺胺峰面积的RSD为3.39 %,结果表明对照品溶液在12 h内稳定。

2.2.3 检测限和定量限 取2.1.3项下对照品溶液,用甲醇逐级稀释至信噪比(S/N)接近10和3,确定4-磺酰胺基苯肼和磺胺的定量限和检测限。结果对磺酰氨基苯肼和磺胺的定量限分别为0.4915 ng/ml和0.5079 ng/ml,对磺酰氨基苯肼和磺胺的检测限分别为0.1474 ng/ml和0.1524 ng/ml。

2.2.4 线性 取混合对照品储备液5 ml,置100 ml量瓶中,甲醇稀释至刻度,作为线性储备液。分别精密移取线性储备液1,2,4,6 ml置100 ml量瓶中,精密移取线性储备液1,2,3 ml置10 ml量瓶中,加甲醇稀释制成系列浓度的溶液,作为线性样品溶液。分别量取5 μl注入液质联用色谱仪,记录峰面积。以浓度(C)为横坐标,峰面积(A)为纵坐标,进行线性回归。结果对磺酰氨基苯肼在0.4915~14.7441 ng/ml浓度范围内线性关系良好,磺胺在0.5079~15.2384 ng/ml浓度范围内线性关系良好,具体结果见表3。

2.2.5 回收率试验 取混合对照品储备液5 ml,置100 ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,作为回收率储备液。精密称取二芳基吡唑类衍生物约20 mg,置10 ml量瓶中,共9份,分为3组,每组分别加入0.1,1,2 ml回收率储备液,甲醇溶解并稀释至刻度,即得回收率样品溶液,另按2.1.3项下方法配制对照品溶液。分别精密量取上述溶液5 μl,注入液质联用色谱仪,按2.1.1项下色谱条件测定,记录色谱图,按外标法,以峰面积计算各杂质的含量,并计算其回收率,结果4-磺酰胺基苯肼和磺胺回收率分别为106.96 %和106.71 %,RSD分别为6.03 %和7.94 %,符合要求,具体结果见表4。

表4 回收率试验结果

2.2.6 精密度试验

2.2.6.1 仪器精密度 取同一份对照品溶液,连续进样6次,测得4-磺酰胺基苯肼和磺胺峰面积的RSD分别为2.55 %和2.03 %,结果表明仪器精密度良好。

2.2.6.2 重复性试验 精密称取二芳基吡唑类衍生物约20 mg,置10 ml量瓶中,加回收率储备液1 ml,用甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,平行制备6份,作为重复性样品溶液。另取2.1.3项下对照品溶液,按2.1.1项下色谱条件测定,记录色谱图,按外标法以峰面积计算各杂质的含量。结果4-磺酰胺基苯肼含量的RSD为3.64 %(n=6),磺胺含量的RSD为0.69 %(n=6),表明重复性良好。

2.2.6.3 中间精密度 不同人员配制6份重复性样品溶液,按2.1.1项下色谱条件测定,记录色谱图,按外标法以峰面积计算各杂质的含量。结果4-磺酰胺基苯肼含量的RSD为3.90 %(n=12),磺胺含量的RSD为4.78 %(n=12),表明中间精密度良好。

2.2.7 样品的测定 取二芳基吡唑类衍生物,按2.1.3项下方法制备供试品溶液和对照品溶液,按2.1.1项下色谱条件,量取对照品溶液和供试品溶液各5 μl,注入液质联用色谱仪,记录色谱图。按外标法以峰面积计算各供试品溶液中4-磺酰胺基苯肼和磺胺的含量。结果多批二芳基吡唑类衍生物中4-磺酰胺基苯肼和磺胺均低于定量限。

3 讨论

3.1 溶剂的选择

二芳基吡唑类衍生物在甲醇中溶解性较好,磺胺和4-磺酰胺基苯肼微溶于甲醇,考虑主成分浓度较大,杂质浓度较小,最终确定以甲醇作为溶剂。

3.2 色谱柱的选择

为了提高杂质检测的灵敏度,本研究选用质谱检测器进行检测。由于较高浓度的样品溶液可能会对质谱检测器造成污染,建立的色谱方法应能实现杂质与主成分峰的很好分离,以便于通过切换阀实现主成分峰不进入质谱检测器。分析磺胺、4-磺酰胺基苯肼和二芳基吡唑类衍生物结构,前两者含1个苯环,后者含2个苯环,试验结果表明对于芳香化合物有特殊选择性的苯基柱可实现磺胺、4-磺酰胺基苯肼与二芳基吡唑类衍生物的较好分离,因此选用苯基柱进行研究。

3.3 流动相的选择

质谱检测器需使用挥发性流动相添加剂,为了优化峰形,使目标物之间、目标物与溶剂峰之间能较好分离,经过试验,使用醋酸铵作为流动相添加剂,调整pH值为4.0,能使磺胺和4-磺酰胺基苯肼实现基线分离。通过调整有机相比例和梯度洗脱,使二芳基吡唑类衍生物出峰时间在5 min之后,切换阀控制主峰不流入质谱,同时确保每次样品测定时主峰能被完全洗脱不影响下一针样品检测。

3.4 限度的确定

本文中二芳基吡唑类衍生物以塞来昔布为模型化合物设计合成,杂质控制限度参考塞来昔布最大日剂量600 mg,按遗传毒性杂质要求进行严控。根据毒理学关注阈值(TTC)1.5 μg/d计算,设定4-磺酰氨基苯肼和磺胺含量均不得过0.00025 %。

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