肿瘤微环境中间充质干细胞与癌症干细胞的关系及其在乳腺癌进展中的作用

李婷婷 刘燕

作者单位：530021 南宁 广西医科大学附属肿瘤医院乳腺及骨软组织肿瘤内科

最新癌症统计数据显示，乳腺癌的发病率在女性癌症中居于首位［1］。在乳腺癌的治疗过程中，复发转移和耐药会降低患者的整体疗效，因此复发转移和耐药成为亟需解决的难题。癌症干细胞（cancer stem cells，CSCs）是显示干细胞特征的癌细胞亚群，被认为是肿瘤发生、耐药及复发转移的重要原因［2］。在乳腺癌中，CSCs 也与耐药及复发关系密切，有研究报道紫杉醇抗性三阴性乳腺癌细胞较亲本细胞显示出更高的球体形成潜力和乳腺癌干细胞（breast cancer stem cells，BCSCs）亚群比例［3］。并且CSCs 也与乳腺癌患者的恶性分级/分期及预后相关［4］。因此阐明乳腺癌细胞获得干性的机制，对进一步深入理解乳腺癌耐药的发生机制，以及开发具有临床应用前景的新型靶点药物都具有重要意义。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种具有自我更新能力、多向分化潜能的干细胞，最早在骨髓基质中被发现，随后在脐带、骨髓、脂肪等多种组织中也发现其存在。MSCs 细胞表面表达CD73、CD90、CD105 等分子，具有分化为至少两种间充质衍生细胞类型的能力［5］。作为肿瘤微环境中的重要组分，MSCs 对肿瘤的发生和发展有着至关重要的作用，能通过直接或间接接触的方式改变乳腺癌细胞的干性分子表达水平，导致乳腺癌细胞向BCSCs 转变，进而促进乳腺癌治疗耐药或复发转移等癌症进展的发生。本文就MSCs 和CSCs 在乳腺癌进展中的作用以及两者的潜在联系进行阐述，为后续开发新的治疗方案以改善乳腺癌患者预后提供方向和借鉴。

1 BCSCs

CSCs 是具有高致瘤效力以及干细胞性质的癌细胞亚群［6］。在乳腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌和前列腺癌等多种实体瘤中均有发现。但在肿瘤微环境中，CSCs的比例较低（＜5%），且与其他类型干细胞具有相似性［7-8］，这加大了特异性识别并靶向CSCs 的难度。目前，CSCs 干性抑制药物在直肠癌［9］、胃癌［10］、胶质瘤［11］中均展现了优秀的抗肿瘤特性和潜在的临床应用价值。但关于靶向BCSCs 药物的相关研究尚在探索中。因此，进一步深入探索BCSCs的调控机制及其标志物具有重要的临床意义。

1.1 BCSCs的分离纯化及鉴定

基于BCSCs的特性，目前开发了多种BCSCs的分选方法：⑴通过检测BCSCs表面分子标志物进行细胞分选。⑵采用无标记BCSCs 分选方法。无标记分选细胞方法利用细胞固有的物理生物特性来分离和分类细胞，不依赖于使用生化标志物来给细胞加上信号标签。2015 年，有研究基于细胞黏附特性，将低黏附细胞与高黏附细胞进行区分，成功富集了BCSCs［12］。⑶采用侧群（side population，SP）细胞分选技术。该技术是在Hoechst 33342 染色后，利用流式细胞仪分析呈Hoechst 33342 低染的细胞［13］，在多发性骨髓瘤［14］中应用最为广泛，在BCSCs 分选鉴定中也有应用［15］。⑷通过体外成球实验使CSCs 可以在非黏附、非分化条件下培养细胞富集［16］。以上四种方法中，流式分选细胞表面标志物方法应用最广泛，但该方法受限于表面标志物的选择。目前CSCs 尚无明确的通用表面标志物，且标志物的选择因各癌种及各亚型而异。侧群细胞分选技术不依赖于细胞表面标志物，但细胞分选纯度较低，异质性高。体外成球实验在分选CSCs中应用较少，主要是作为鉴定细胞干性的常规实验。而无标记分选方法是近年来出现的较新的CSCs 分选方法，对于该方法的研究目前比较局限，尚需进一步的探索和完善。

1.2 BCSCs表面标志物

CSCs 标志物的表达因癌症亚型而异，甚至在同一亚型患者之间也存在差异［17］。关于BCSCs 的表面标志物，自2005 年PONTI 等［18］研究发现表达CD44+/CD24-/low的乳腺癌细胞保留了致瘤活性并显示干细胞样特性以来，CD44+/CD24-/low 就被作为BCSCs 的经典表面标志物在乳腺癌干性模型研究中广泛应用［19］，但仅依靠CD44 和CD24 的表达并不能完全识别所有乳腺癌亚型的干细胞［20］。直至2007 年，GINESTIER 等［21］研究表明ALDH1 是人类正常和恶性BCSCs 的标志物，可作为BCSCs 的表面标志物之一，自此ALDH1与CD44+/CD24-/low共同作为分选和鉴定BCSCs 的标志物。近期研究发现，白血病中CSCs 标志物CD96也在BCSCs 中高表达［22］，但其作用仍需进一步研究。

1.3 BCSCs在乳腺癌进展中的作用及机制

1.3.1 BCSCs 在乳腺癌进展中的作用 BCSCs 在乳腺癌的复发、转移和治疗耐药过程中有着至关重要的作用［23］。WU 等［24］发现BCSCs 能通过其自身分泌的DKK1 增加SLC7A11 的表达，以保护转移的癌细胞免受脂质过氧化和铁死亡，从而促进了乳腺癌转移。在癌症转移过程中，肿瘤细胞可能会进入休眠状态，到达转移部位后，在适宜的环境下再次增殖，形成转移［25］。BCSCs以其独特的无限自我更新能力，促进并形成转移性休眠后的乳腺癌复发［26］。化疗、放疗等会增加乳腺癌微环境中的CSCs 比例而导致治疗失败和疾病复发［27］，通过阻断化疗诱导的BCSCs 富集，可以延长化疗后肿瘤复发的时间［28］。BCSCs 还可以通过激活NF-κB 信号通路促进乳腺癌的化疗耐药［29］。BEZIAUD 等［30］研究发现，免疫治疗会促进BCSCs 标志物的表达增加，在乳腺癌小鼠模型中BCSCs不仅显示出对T 细胞毒性的抵抗力增强，而且由活化的T 细胞产生的干扰素γ（IFNγ）可直接将非BCSCs 转化为BCSCs，表明BCSCs 与乳腺癌的免疫治疗抗性密切相关。以上研究结果提示，BCSCs 在乳腺癌复发、转移、治疗耐药等方面均有影响，靶向清除BCSCs可能是有益于乳腺癌转变复发、转移和治疗耐药的潜在途径。

1.3.2 乳腺癌细胞干性表达的调控机制 相较于正常的乳腺癌细胞亚群，BCSCs 具有更强的成瘤能力且更易对治疗产生抵抗性。BCSCs 在化疗药物刺激下会促进CSCs 的自我更新能力［31］，肿瘤微环境则是CSCs 增强耐药机制的“巢穴”［32］。目前，BCSCs 相关调控机制主要包括以下方面：⑴上皮-间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）可以赋予癌细胞类似干细胞的表型。PARK 等［33］证明了乳腺癌化疗药物紫杉醇诱导的间充质性状增强了癌细胞的干性，并且部分由SNAIL 介导。⑵通过干性相关信号通路TGF-β、Hippo、Wnt、Notch、JNK-JUN 等调控乳腺癌细胞干性［34］。化疗诱导的TGF-β 信号传导可通过IL-8依赖性CSCs 扩增促使肿瘤复发［35］；Hippo 信号通路能维持BCSCs 的自我更新和肿瘤起始能力［36］；另外，还有一种独特亚型的未成熟自然杀伤细胞Socs3highCD11bCD27，在小鼠中可通过Wnt 信号激活癌症干细胞［37］。⑶lncRNA、miRNA、RNA结合蛋白等多种分子可以通过激活干性相关通路，维持或促进乳腺癌细胞的干性。如长链非编码RNA lnc030 可以与PCBP2 协同稳定SQLE mRNA，从而增加胆固醇合成，激活PI3K/Akt 信号通路，维持乳腺癌干细胞的干性［38］。RNA 结合蛋白Lin28B 可以能通过增强乳腺癌细胞的干性促进乳腺癌的进展［39］。⑷通过调控代谢相关基因维持乳腺癌细胞干性。WANG 等［40］发现脂肪酸β氧化是维持BCSCs 所必需的，并有助于乳腺癌的化疗耐药。另外，BCSCs 主要代谢模式为有氧糖酵解，与Caveolin-1（Cav-1）的下调相关，因此Cav-1靶向治疗也可能是消除BCSCs有希望的策略［41］。⑸生物力学环境。生物力学环境对CSCs 具有一定的支持作用。LIU 等［42］通过使用超声弹性成像和原子力显微镜检查手术样本，发现基质硬度增加与乳腺癌患者对新辅助化疗反应差、预后较差和CSCs 富集有关。该研究还发现生物力学激活的TAZ通过与NANOG分离增强了CSCs 性能。肿瘤微环境的缺氧特性也参与癌细胞的干性调控，而缺氧也会导致BCSCs富集。⑹其他调控机制。有研究通过转录组学分析鉴定出一种支架蛋白SH3RF3（也称为POSH2），其在乳腺癌组织及细胞系的CSCs中均表达上调，而且能增强乳腺癌细胞的CSC性质［43］。还有研究报道，维生素D可通过下调乳腺癌干细胞CSCSUM159 中的Wnt/β-catenin 信号通路活性进而抑制BCSCs［44］。总之，目前对于乳腺癌细胞干性的调控机制的探索仍在不断地拓展中，其中干性相关通路是研究的热点及重点，未来继续深入研究并阐明其中调控机制，对开发针对BCSCs的治疗方案，以及改善乳腺癌患者的预后具有重要意义。

2 MSCs

2.1 MSCs在肿瘤免疫微环境中的作用

MSCs 具有炎症趋向性，并且在多种实体瘤包括乳腺癌组织中已证实MSC 的存在［45］。MSCs 在肿瘤微环境中主要通过调节免疫、旁分泌等方式影响肿瘤进展。有研究发现，处于转移前阶段的肺间充质基质细胞（LMSC）中补体3（C3）上调，促进了中性粒细胞募集和中性粒细胞外陷阱（NETs）的形成，从而促进癌细胞转移到肺部［46］。另外，MSCs中Hedgehog信号激活能促进成骨细胞分化，成骨细胞沉积胶原蛋白，通过抑制性LAIR1信号传导抑制NK细胞并促进肿瘤定植［47］。

2.2 MSCs在肿瘤基质微环境中的作用

近年来，有研究表明，MSCs 可以分化为癌症相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblast，CAFs）而发挥作用［48］。而Grem1 蛋白是乳腺癌细胞与CAFs 相互作用的关键因素，可促进癌细胞侵袭［49］。还有研究在脂肪来源的间充质干细胞（ADSCs）与MCF-7 在基质凝胶共培养的结果中发现ADSCs 具有肿瘤趋向性，这可能是受趋化因子的调节，例如巨噬细胞炎症蛋白（MIP）-1δ 和MIP-3α 等；此外还发现ADSCs 能在体外诱导肿瘤球形成并促进体内致瘤性［50］。MSCs除了具有促肿瘤作用外，也在部分研究中显示了抗肿瘤和抗转移特性，其具体作用取决于促肿瘤和抗肿瘤分子分泌的平衡［51］。例如有研究发现人脐带间充质干细胞来源的外泌体通过miR-21-5p/ZNF367 途径抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭［52］。由此可见，MSCs 在肿瘤进展中的作用具有多样性，机制繁杂，仍需进一步深入研究。

3 CSCs和MSCs在乳腺癌中的调控关系

关于MSCs在乳腺癌进展中的机制研究已广泛开展，但大部分研究集中在MSCs 与正常乳腺癌细胞之间的串扰，对于MSCs 与CSCs 之间的作用机制网络还知之甚少。细胞之间通过多种途径传递信号进行信息交流，从而发生作用。细胞间的通讯方式可分为直接接触和间接接触，直接接触包括细胞间的识别和结合或通过通道进行信息交换等；间接接触主要是通过细胞外基质中的介质，如细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）等传递具有生物活性的因子或信号分子，或细胞直接释放信号分子来进行细胞间的信息传递。

3.1 MSCs通过与CSCs直接接触影响乳腺癌细胞的干性

LIU等［53］将SUM159乳腺癌细胞与人骨髓来源的MSCs 共培养后，通过流式细胞术分离细胞群，并通过ALDEFLUOR 测定法评估表达ALDH 的群体，发现相较单独培养，与MSCs 共培养的ALDH+乳腺癌细胞比例提高了3 倍以上。说明MSCs 对乳腺癌细胞的干性有促进作用，且该作用可由两种细胞直接接触发生。PATEL 等［54］在调查不同的乳腺癌细胞亚群如何与MSCs 相互作用以极化T 细胞反应的过程中发现，CSCs 与MSCs 的亲和力度最高。在一项近期研究［55］中也发现，MSCs 与ER+乳腺癌细胞直接接触共培养，可使乳腺癌细胞获得癌症干样表型，并且对标准抗雌激素药物的耐药性增强。

3.2 MSCs通过外泌体传递诱导乳腺癌干性表达的信息

EVs 是一类从细胞释放到细胞外基质的膜性囊泡，根据其直径和发生方式的不同，主要分为外泌体（exosome，EXO）、微泡、凋亡小体和癌小体。外泌体因其包含复杂的RNA 和蛋白质，可以穿梭传递多种信号分子，在细胞通讯中发挥重要调节作用，故而研究最为广泛。迄今为止，外泌体在癌症诊断、癌症治疗和预后预测中已经显示出巨大的潜力［56］。有研究将人骨髓来源的MSCs与骨髓转移性人乳腺癌细胞系共培养后，可观察到乳腺癌细胞增殖、侵袭能力被抑制，干细胞样表面标志物的丰度和对多西他赛的敏感性降低；同时，提取MSCs培养上清液的外泌体与乳腺癌细胞系共培养后也观察到了同样的现象，经过进一步研究发现该作用主要是由外泌体中的miR23b 及其靶基因MARCKS 介导［57］。说明MSCs 外泌体对乳腺癌细胞干性表达具有潜在的影响。此观点在2021年，SANDIFORD等［58］的研究中也得到了进一步验证。该研究发现MSCs分泌的EVs主要影响Wnt信号通路，在乳腺癌细胞去分化为BCSCs的过程中发挥作用。综上所述，MSCs可能通过外泌体介导传递信号分子影响乳腺癌细胞的干性，但仍需在更多的实验中加以验证。

4 BCSCs在乳腺癌治疗中的前景

自BCSCs 在乳腺癌进展中的关键作用被发现以来，研究者开展了诸多相关机制研究，极大地丰富了乳腺癌治疗靶点，在充分理解BCSCs的上游表达机制和下游生物学功能的基础上，BCSCs 在乳腺癌治疗中显示了巨大的应用前景：⑴通过构建纳米递送平台实现CSCs的靶向治疗。SUN等［59］设计了一种基于金纳米颗粒的药物递送系统，将化疗药物多柔比星递送到CSCs，降低了乳腺球形成能力和癌症起始活性，并抑制了小鼠模型中的肿瘤生长。该研究改变了常规化疗药物无法杀伤CSCs 并且反而富集CSCs 的缺陷，使传统的化疗药物有望用于癌症干细胞治疗。⑵通过新型疫苗接种方法消除CSCs。该方法可通过将ALDH表位肽传送到抗原提呈细胞（APCs），从而引起T细胞反应，抑制ALDHhigh的CSCs，可能为CSCs 的癌症免疫治疗开辟新的途径［60］。⑶改变CSCs 的生物学功能。FTO 是一种核糖核酸N6-甲基腺苷（m6A）去甲基化酶，具有致癌作用。有研究表明，FTO 在CSCs 自我更新和免疫逃避中起着关键作用，通过靶向抑制FTO，可以减弱CSCs的自我更新，显示了靶向CSCs的癌症治疗潜力［61］。还有研究报道，二甲双胍可介导miR-708靶向抑制CD47，从而抑制BCSCs的自我更新能力［62］。另外，BCSCs 普遍存在于乏氧肿瘤环境中，因此传统化疗对BCSCs 的效果不佳。KIM 等［63］报道了一种分子结构AzCDF，可以在乏氧肿瘤环境中选择性地靶向BCSCs，从而减少CSCs 迁移，延缓肿瘤生长，并降低肿瘤发生率。⑷靶向BCSCs表面标志物消除CSCs。目前该途径仍具有挑战性，但最近一项研究发现，exportin-1（又称CRM1，是一种染色体维持蛋白）与乳腺癌细胞的活力和凋亡有关［64］。其天然高效小分子拮抗剂LFS-1107 可以选择性消除CD44+CD24-富集的BCSCs，并在体内外实验以及来源于临床患者样本的类器官中得到了验证［65］。除了以上方面，XIONG 等［66］设计了一种基于pH 响应性羟乙基淀粉前药、铜离子和葡萄糖氧化酶（GOD）自组装的多功能级联生物反应器（HCG），其由高压氧（HBO）赋能，主要用于侵袭性乳腺癌治疗，该研究显示HCG 与HBO结合可显著抑制原位乳腺肿瘤的生长，并能通过抑制CSCs抑制肺转移。综上所述，目前诸多研究已经在细胞和动物模型中验证了通过靶向抑制或消除CSCs对乳腺癌进展具有重要作用，显示了BCSCs巨大的潜在治疗作用，但是在临床试验中基于CSCs治疗方案的高质量研究仍有很大空缺，需进一步加深对CSCs调控肿瘤进展作用机制的理解，为临床转化奠定基础。

5 小结

BCSCs 在乳腺癌的发生及进展中扮演重要角色，是乳腺癌治疗中的关键靶点。但目前对于BCSCs 的研究尚处于初步阶段，现有临床转化研究结果仍不理想。在乳腺癌肿瘤微环境中，MSCs 能通过直接或间接接触引起乳腺癌细胞的干性改变，进而影响细胞表面干性相关标志物的表达和乳腺癌细胞的去分化等，但具体机制尚未完全阐明。未来进一步深入了解MSCs 与BCSCs 的调控机制，可能为靶向BCSCs 相关治疗提供一个新的切入点，有益于改变当前靶向BCSCs 的治疗困境，对改善乳腺癌患者预后具有重要的临床意义。