地皮菜水应激蛋白的研究进展

陈晓霞,路晓庆,张桓虎

(1. 山西医科大学 第二临床医学院,山西 太原 030001;2. 山西省肿瘤医院,山西 太原 030001)

普通念珠藻(图1)俗称地皮菜[1],属于蓝藻门念珠藻属[2],在全国各地均有所分布,因其丰富的营养价值和特殊的生物活性,而具有重要的药用价值[3]。地皮菜中重要的组成部分水应激蛋白,属于酸性多肽,等电点(PI)位于4.3～4.8[4-5]。目前,水应激蛋白已被发现广泛存在于念珠藻属中,但其在地皮菜中的含量更为丰富,其中,细胞外基质总蛋白量可达83.6%[6]。水应激蛋白的一些生物学活性,包括抗辐射、抗干旱和抗瘤性等都显示其具有重要的研究价值[7]。

图1 野生的念珠藻[1]Fig.1 Wild N. commune vauch[1]

1 水应激蛋白的来源

地皮菜由细胞细丝和大量细胞外基质组成,水应激蛋白则是地皮菜细胞外基质的特征性成分[8],对于维持细胞外基质的结构功能具有重要作用[9],可通过基因表达及蛋白质水解产生。这些具有异质性,在基因型中具有高度的多样化,所表达的一系列蛋白被统称为水应激蛋白[8]。其经胞内降解和修饰后,相对分子量大小各异。Sokamoto等[10]报道称:水应激蛋白是1个单拷贝基因,由1个单顺反子的操纵子调控,其各种亚型可能是由于脱酰胺、共价修饰或者是由蛋白酶水解构成。

2 水应激蛋白的结构

目前,关于水应激蛋白质的结构尚未明确。同源建模作为一种模拟蛋白质三维结构的常规技术,具有很强的权威性[11]。而蛋白质三维结构(SWISS-MODEL)是目前最具有权威性的系统[12-13]。根据已知的水应激蛋白基因片段,使用SWISS-MODEL对水应激蛋白的3D结构进行了预测,结果见图2。其具体蛋白质结构的测定还需要依赖核磁共振和X线晶体学等技术的辅助验证。蛋白结合位点仍需要借助肺通气功能(PFT)成像功能化探针等技术进一步确定,以期寻找出特异性识别位点[14]。

图2 水应激蛋白的3D预测结构Fig.2 3D predictive structure of N. commune vauch

3 水应激蛋白的制备

3.1 水应激蛋白的提取和分离

目前对地皮菜的研究多集中于水应激蛋白的活性功能方面,运用合适的手段从地皮菜中提取分离出高质量的水应激蛋白具有重要的理论和现实意义。目前,主要通过水提法、盐提法和酸提法等方式提取植物蛋白[15]。由于水应激蛋白在干燥念珠藻中的含量较为丰富,因此,可采用生物化学手段,如:丙酮硫酸铵沉淀法[16-17]。该方法简单快捷,能有效提取水应激蛋白[18]。但仍存在一些问题,例如:分离不充分时,会导致杂质混于样品中。另外,较长时间的样品浸泡,会影响丙酮对水应激蛋白的修饰。针对上述问题,应继续研究相关的水应激蛋白提取、分离方法,以期寻找出更合适的提取方案,来增加提取纯度,为水应激蛋白的深度提纯和开发创造条件。

3.2 水应激蛋白的诱导表达

除了物理方法外,也可通过基因重组技术诱导原核系统对水应激蛋白进行大量表达[19]。考虑到遗传学、生物化学和分子生物学等方面,大肠杆菌已成为众多异源蛋白质的首选表达系统[20]。

目前,学者们通过对表达与纯化条件的不断优化,成功获得了具有生物活性的水应激蛋白[17],为其开发利用提供了基础。此外,进一步的截短优化,成功获取到了免疫反应小、安全性高的活性肽,并明确了截断体活性片段的生物活性[17],也为研究水应激蛋白各保守结构,细化各结构域的生物活性创造了条件[21]。

4 水应激蛋白的生物活性

4.1 抗干旱作用

干旱胁迫是导致作物减产的重要环境因素[22]。植物可感知缺水信号,并启动应对策略的能力被定义为抗旱能力[23]。地皮菜在干旱或湿润的环境中都具有很强的适应能力。在干旱过程中,能处于一种“静息”状态,降低生存活动,此过程可长达100年[24]。而当水源充足时,便会迅速恢复其原有的生存能力,重新进行呼吸及光合作用[25]。早在20世纪80年代,学者们已经在结构、生理和生化水平上对地皮菜的干燥耐受性进行了研究[26]。Ye等[27]报道了水应激蛋白在蓝藻类生物抵抗干旱环境中起到的关键作用。Scherer等[28]研究发现:当菌落经受干燥和再水化的重复循环时,地皮菜会积累一组新的酸性蛋白质,即为水应激蛋白;其经由再水化后,分泌到细胞外多糖鞘中,以维持基质的保护作用,为细胞提供生存保护[6,29]。总之,水应激蛋白在地皮菜遭遇环境胁迫,特别是在干旱时,发挥着重要作用,即水应激蛋白可能是一种具有细胞应激抗性的蛋白。

4.2 抗辐射作用

地皮菜可适应具有高水平辐射的环境[10]。在黑暗条件下进行培养,会造成水应激蛋白的缺失,而紫外线会影响水应激蛋白mRNA的扩增,导致水应激蛋白分泌增加,使扩增比例最高可达4倍[30]。由此说明:水应激蛋白在抗辐射中发挥着重要作用[9]。现今社会发展迅速,人们受到辐射损伤的风险大大增加,因此,需要不断寻找更为有效、安全的抗辐射药物。Peng等[31]和伦博书等[32]研究认为:部分中药具有辐射保护作用,可抗自由基,抑制DNA的损伤,且具有更少的副作用。因此,地皮草中的水应激蛋白有望被开发为一种新的抗辐射制剂。

4.3 抗肿瘤活性

近年来,国内外学者围绕水应激蛋白的抗癌功效也进行了一系列研究。Guo等[5]的研究结果证实:水应激蛋白可通过杀灭结肠癌细胞(HCT-116、HT-29和SW480)来阻滞结肠癌细胞的增殖,而这种杀伤作用对正常肠上皮细胞几乎无影响。水应激蛋白还可通过G1/S阻滞诱导生长,介导含半胱氨酸蛋白酶(caspase)依赖途径,诱导细胞的凋亡[5]。通过靶向受体FZD1,水应激蛋白通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路,从而发挥抗结肠癌的效应[17]。同时,郭松佳[33]进行了裸鼠实验,同样证实了在机体水平,水应激蛋白可以损伤肿瘤细胞,而对正常细胞无影响。

在肿瘤发展过程中,肿瘤转移是影响预后的重要环节,通常可通过黏附改变,诱导转移开端[34]。近年来,郭松佳等[35]发现:水应激蛋白能够抑制结肠癌细胞的侵袭和浸润。这一过程是通过促进人结直肠腺癌上皮细胞(DLD1)细胞间的黏附,以降低细胞-基质间黏附的实现,同时,此过程由钙黏蛋白E(E-cadherin)及神经钙黏素(N-cadherin)等关键分子以及下调PI3K/ AKT/mTOR通路激活自噬介导,证实了念珠藻水应激蛋白具有显著的抗结肠癌活性[36]。目前,本课题组正在研究水应激蛋白抗胃癌及对其他肿瘤的效果,以期可以为肿瘤患者提供新的治疗方法。

4.4 糖苷酶活性

水应激蛋白具有β-D-半乳糖苷酶活性,并且与1,4-β-D-木糖苷酶活性相关,可参与细胞周围高分子聚合物的水解[37]。β-D-半乳糖苷酶通过催化乳糖,可进一步水解生成葡萄糖和半乳糖[38]。1,4-β-D-木糖苷酶在木聚糖降解的过程中起着重要的作用,可通过木糖和木糖寡糖的非还原末端连续去除β-木糖基残基,从而在木聚糖水解期间减轻内切木聚糖酶的终产物抑制效应。降解之后的木糖对于念珠藻共生的细菌及真菌生长过程均具有重要作用,可帮助细胞扩散,从而扩大该蓝藻的菌落[39]。

5 应用前景与展望

5.1 提取工艺的优化

目前,水应激蛋白的提取工艺,诸如:丙酮沉淀提取法具有残留杂质多、会破坏有效成分等缺点,而基因工程表达的蛋白常常会形成不溶性的包涵体,丧失其原有生物功能。因此,寻找合适的蛋白提取工艺,尤其是将各法所提取的蛋白在各项指标上进行比对,具有重要意义。

5.2 农作物抗旱及抗辐射的应用

对于植物抗干旱能力的提高已成为目前作物研究的一大热点。但尚未有过表达水应激蛋白能否改善作物抗干旱能力的相关报道,因此,深入利用水应激蛋白的抗旱特性,有望提高作物抵御严重干旱和抗紫外线辐射的能力。

5.3 抗消化系统肿瘤的应用前景与对分子机制的研究

目前,水应激蛋白对于肿瘤细胞的调控机制尚不完全清楚,并且缺乏其激活下游信号通路的机制说明。根据已获取的基因序列,对水应激蛋白及受体蛋白的结合效果进行模拟,以寻找受体蛋白,对于筛选出靶标受体具有重要的参考价值。目前,国内外研究者仍在不断挖掘中草药中的抗癌成分,并以此为基础,提取了大量有抗癌潜力的成分。研究提示:水应激蛋白在消化道肿瘤中可能发挥着重要的作用,具有重大的研究意义。

5.4 蛋白制剂的开发

药物研发人员可以根据水应激蛋白的特性,利用蛋白质工程技术进一步开发出适用于肿瘤患者的蛋白药物。基因工程可以实现水应激蛋白的大量制备。然而对于蛋白质类药物而言,其相对分子量大,给药周期长而频繁。如何利用新的生物技术,以提高水应激蛋白的生物利用度,对水应激蛋白进行改造修饰,稳定其生物活性,仍值得进一步研究。因此,水应激蛋白仍具有巨大的医学应用潜力。