乳腺癌休眠机制研究进展

马澜婧，张百红

0 引言

乳腺癌（breast cancer, BC）是全世界女性死亡的首要元凶，肿瘤复发转移则是乳腺癌相关死亡的主要原因。微小残留病灶（minimal residual disease, MRD）的存在是肿瘤复发转移的生物学基础，乳腺癌患者在初诊时即可能携带微转移[1]。全身辅助治疗的目的就在于消除播散性肿瘤细胞（disseminated tumor cells, DTC）以降低复发率，然而仍有部分DTC能够逃避初治治疗，作为最小MRD持续存在，并在原发肿瘤切除后数年甚至数十年保持静止，这种特定的生物学行为称为肿瘤休眠（tumor dormancy），这些细胞被称为休眠癌细胞（dormant cancer cell, DCC）[2-3]。

肿瘤休眠的概念是1954年由Hadfield首次提出。DCC的特点是有丝分裂停滞在G0/G1期和低代谢，通过获得突变和表观遗传修饰来适应新的微环境，使其对抗肿瘤治疗和免疫监测具有抵抗力实现静止状态下长期存活[4]。不幸的是，肿瘤休眠是一个可逆的增殖停滞状态。在适当的环境条件下DCC能够“苏醒”，恢复其增殖，最终导致远处转移和癌症相关死亡。较为公认的DCC生命周期包括休眠——复苏——出芽——种植[5]。DCC常定植的组织器官包括骨髓、肝脏、肺脏、脑、骨骼肌等[6]。但是对于DCC如何逃避治疗、维持表型、重新唤醒等仍然知之甚少，对休眠机制的研究具有重大意义。已报道的控制DCC命运的核心机制涉及经典信号通路、免疫反应、表观遗传修饰、代谢重编程、非编码RNA以及肿瘤细胞和微环境之间的相互作用等。本文重点归纳以乳腺癌模型为基础的有关休眠内在分子机制研究的最新进展。

1 自噬

自噬是一种以细胞成分和细胞器的溶酶体降解为特征的细胞分解代谢过程，是对各种细胞应激的适应性反应，包括DNA损伤、缺氧、营养和营养因子信号耗竭以及化学损伤等。自噬被证明是休眠的乳腺癌细胞（breast cancer cell, BCC）生存的关键策略之一。

1.1 自噬激活保护DCC

最早Cufí发现自噬可以正向调节乳腺癌干细胞（breast cancer stem-like cell, BCSC）表型[7]。而普遍认为具有激活休眠和引发复发转移性病变能力的DTC正是BCSC[8]。Ovadia团队构建了一种仿生3D合成基质休眠模型，观察到根据基质密度的不同，ER阳性BCC呈现出休眠或持续生长状态，三阴性BCC从未进入休眠状态，并且该模型中自噬相关基因显著差异表达[9]。Vera-Ramirez团队亦构建了一个3D休眠细胞培养模型，发现抑制自噬可使休眠的BCC存活率和转移负担显著降低，其潜在机制可能是抑制自噬后活性氧等有害物质累积并损害其自身线粒体进而导致细胞凋亡[10]。有研究证明自噬激活可以抑制免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤，通过免疫逃逸促进DTC的生长[11]。乳腺癌复发通常发生在比正常乳腺或原发性乳腺肿瘤更“软”的组织中，如骨髓、脑和肺。研究发现在更“软”的微环境中，由于自噬增加和雌激素受体α表达减少，乳腺癌细胞对他莫昔芬更具抵抗力，抑制自噬可增强BCC对他莫昔芬的反应，也就是说，组织力学通过影响自噬调节乳腺癌的预后[12]。最新研究发现AIH1在乳腺癌的体外和小鼠异种移植物模型中亦能触发自噬，并促进DCC的存活[13]。综上自噬激活对DCC起保护作用。

1.2 抑制自噬促进DCC苏醒

关于肿瘤休眠的一个关键但尚未充分认知的问题是，哪些事件可以诱导DCC的苏醒？Aqbi等研究发现，在接受阿霉素治疗的HER2过表达的小鼠乳腺癌模型中，永久抑制自噬可导致DCC早期脱离休眠和复发[14]。2019年的一项研究发现6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3（Pfkfb3）的表达与自噬呈反比，自噬降低了Pfkbb3的表达并引发细胞休眠；抑制自噬可复原休眠的BCC中Pfkfb3的异常表达，并重新激活细胞增殖生长[15]。目前许多针对自噬的治疗正在进行，以最大限度地减少休眠BCC数量[16]。

2 免疫反应

2.1 免疫逃逸

免疫逃逸是假设癌症细胞通过某些“隐身或抵抗”机制躲避免疫细胞的破坏[11]。抑制免疫反应和免疫逃逸是DCC的特征之一[17]。例如休眠的骨髓瘤细胞被错误地识别为健康骨髓细胞，从而避免了免疫监视[18]。DTC还可以通过下调主要组织相容性复合体-Ⅰ的表达逃避免疫监视[19]。在急性髓细胞白血病模型中， PD-L1的过度表达可导致白血病细胞对细胞毒性T细胞介导的杀伤更具抵抗性[20]。这不仅是临床上应用PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂抗肿瘤治疗的理论基础，也可能是肿瘤休眠的机制之一。Watt等研究发现CDK4/6抑制剂诱导了以广泛增强子激活为特征的BCC染色质重塑，新激活的增强子包括逃避细胞凋亡的经典超级增强子[21]。这也是保护休眠细胞免受免疫消除的潜在机制之一。

内质网应激是一种细胞自主反应，亦有研究提示内质网应激能够帮助DCC逃避免疫监视并建立隐蔽转移[22]。在肿瘤形成的早期，驻留在组织中的巨噬细胞在肿瘤细胞附近聚积，以促进肿瘤细胞的上皮-间质转化和侵袭，它们还诱导强大的调节性T细胞反应，保护肿瘤细胞免受适应性免疫的影响[23]。干扰素调节因子7（interferon regulating factor 7, IRF7）高表达与乳腺癌患者的无骨转移生存率相关，其机制可能是IRF7参与了对休眠BCC的主动免疫监视，当IRF7受到抑制时，BCC通过免疫逃逸实现骨转移[24]。进一步研究发现BCC中IRF7的激活诱导免疫反应从髓源性抑制细胞主导向CD4+/CD8+T细胞显性反应转变，敲减肿瘤细胞中的IRF7可逆转休眠，IRF7的上游因子干扰素-β减少可使DCC自发脱离休眠，并且ER阴性乳腺癌患者的无远处转移生存期与干扰素-β相关[25]。

2.2 其他免疫反应

除了免疫逃逸，还有其他免疫反应亦参与乳腺癌休眠。目前已报道4种小鼠BCC可表现为肺部休眠，有趣的是每种细胞系（67NR、4T07、EMT6和D2.OR）肺休眠机制都表现出一定程度的免疫依赖性[26]。具体而言，67NR细胞休眠可以被脂多糖引发的炎性反应唤醒[27]。4T07细胞可以激发产生系统性的CD39+/PD-1+/CD8+T淋巴细胞反应，有利于肺部转移性休眠，乳腺癌患者中这种特异性T淋巴细胞亚群与无病生存期之间的相关性佐证了这一点[28]。EMT6细胞肺休眠受髓系来源的抑制性免疫细胞和CD8+淋巴细胞之间的相互作用影响[29]。D2.OR细胞可以通过给予脂多糖[30]或诱导纤维化[31]从休眠中唤醒。

巨噬细胞在休眠方面似乎是一把双刃剑，一方面骨内膜定植的巨噬细胞可能通过与表面蛋白之间的直接相互作用，调节播散性BCC的休眠，赋予其化疗抵抗力并诱导细胞周期阻滞，另一方面toll样受体4的激活可以反向刺激巨噬细胞转变为促增殖细胞，这也表明炎性反应可能在促进休眠BCC苏醒中发挥作用[32]。Correia等构建了乳腺癌肝转移的小鼠模型，发现在休眠环境中NK细胞有选择性地增加，NK细胞通过干扰素-γ信号通路维持休眠，在NK细胞明显收缩并积聚活化的肝星状细胞后休眠结束[33]。这些发现强调了免疫反应在乳腺癌休眠中的重要性。

3 表观遗传

DCC在增殖和休眠状态之间波动也可能是表观遗传改变的结果[4]。Shimizu等研究提示E3泛素连接酶FBXW7过表达可诱导癌基因C-MYC和细胞周期蛋白E的泛素化降解，进而限制肿瘤细胞进入细胞周期，FBXW7基因敲减可破坏DTC静止状态，诱导其增殖[34]。有丝分裂原和应激激活激酶1（mitogen- and stress-activated kinase 1, MSK1）是一种染色质激酶，可通过组蛋白H3磷酸化改变染色质结构，促进激活剂依赖性转录[35]。Sylwia等研究显示MSK1高表达与ER阳性乳腺癌患者晚期复发转移有关，MSK1可通过调节启动子染色质状态控制细胞分化相关基因的表达，进而调控BCC休眠[36]。

4 代谢

核因子E2相关因子2（nucleal factor erythroid-2-related factor 2, NRF2）是一种调节氧化应激和抗氧化反应的关键转录因子。2019年Zhang等发现NRF2可通过上调G6PD/HIF-1α/Notch1信号通路表达促进BCC迁移[37]。Fox等进一步研究发现，BCC中HER2下调促进细胞代谢，导致NRF2的代偿性上调；在预后不良的乳腺癌动物模型中观察到NRF2在休眠期和复发肿瘤中被激活，且NRF2诱导代谢重编程以重建氧化还原稳态；NRF2的组成性激活加速复发，而抑制NRF2延缓复发，这些数据提示NRF2驱动的代谢重编程可能促进隐匿性乳腺癌复发[38]。该团队随后的研究发现，抑制谷氨酰胺酶能够阻止体外DCC的再激活，并且NRF2驱动的复发性BCC对谷氨酰胺酶抑制敏感性增加，因此提出了一种控制乳腺癌复发的潜在新策略[38]。

5 肿瘤微环境

DTC在生态位中的休眠可以被认为是一种适应性状态，最近的研究表明肿瘤微环境很大程度上参与了诱导、维持或中止BCC休眠[39]。

5.1 缺氧

人乳腺癌细胞系能够在1%氧气条件下稳定存活并进入休眠状态，若恢复正常氧供细胞在2周内恢复增殖，其机制可能与慢性缺氧诱导自噬有关[40]。故自噬可能是休眠的BCC在缺氧微环境中生存的关键策略之一[41]。另一项研究认为缺氧通过下调LIFR/STAT3/SOCS3信号通路赋予骨髓中BCC的休眠表型[42]。氯化钴可在MCF-7和MDAMB-231细胞系中模拟缺氧诱导的癌细胞休眠，且该休眠模型是缺氧诱导因子1α依赖性的[43]。

5.2 细胞外基质

Fang等最早发现将MDA-MB-231细胞包埋在较硬凝胶中则表现出细胞形态改变、簇形成、倍增时间延长和代谢速率减慢等休眠状态[44]。Liu等也发现坚硬的机械环境可以诱导干细胞样肿瘤再生细胞休眠[45]。Pradhan等为了验证细胞外基质对DTC命运的影响，在16种不同化学（配体密度和酶降解性）和机械（弹性、溶胀、网孔大小）特性的水凝胶支架中观察MDA-MB-231细胞生长/休眠状态，发现配体密度和酶降解性可能对DTC命运影响最大[46]。

Barney团队构建了一个可以精细控制细胞外基质的体外细胞培养系统，通过实时成像观察癌细胞休眠的进入和退出，发现能够进入长期休眠存活的细胞分布于不同细胞周期，其共同特征是通过整合蛋白黏附形成有组织的纤维连接蛋白基质，休眠后的癌细胞重启生长需要降解纤维连接蛋白[47]。Montagner等进一步发现BCC和肺泡上皮细胞相互作用可促进整合蛋白依赖的纤维连接蛋白形成，且该过程由分泌卷曲相关蛋白2介导[48-49]。

5.3 血管周围生态位

Ghajar等最先设计了器官型血管周围生态位（perivascular niche, PVN）模型以确定内皮细胞是否直接影响BCC的生长；这些模型表明内皮衍生的血小板反应蛋白-1诱导BCC保持静止；这种抑制性作用在发芽的新血管系统中丢失；时间推移分析表明，发芽的血管不仅允许，而且加速BCC的生长；也就是说稳定的微血管构成了维持休眠的生态位，而发芽的新血管则引发了DCC转移性生长[50]。Patrick等研究发现在整合蛋白介导下，DTC可与定植部位PVN相互作用而免受化疗的影响，该作用与细胞周期无关，使用整合蛋白抑制剂可在不诱导DTC增殖或加剧化疗相关不良反应的情况下实现化疗增敏[51]。骨髓是DCC定植最常见的部位之一[6]。Oleta等研究表明在Wnt-β-连环蛋白途径介导下，DTC与骨髓基底细胞PVN相互作用后去分化成为癌症干细胞，从而成功启动早期休眠[52]。也有研究表明PVN通过上调PD-L1的表达水平为肿瘤细胞创造了一个免疫抑制的微环境[53]，这为临床上抗血管生成治疗和免疫治疗联合使用提供了理论基础。

5.4 成骨细胞

Hughes等观察到在小鼠体内模型中，骨髓中播散的BCC往往定植在富含成骨细胞的部位；体外试验进一步验证成骨细胞可以保护BCC免受细胞应激诱导的死亡[54]。Kolb等研究认为造血干细胞（hematopoietic stem cells, HSC）生态位中的一些成骨细胞通过与BCC相互作用支持休眠状态而被激活，它们获得抑制三阴性和ER阳性BCC增殖的能力，在延缓BCC生长中发挥作用[55]。后续研究认为被激活的成骨细胞产生的细胞外小泡可减少BCC进入S期进而抑制细胞增殖[56]。

5.5 间充质干细胞

Nobre等研究发现骨髓驻留的间充质干细胞（mesenchymal stroma/stem-like cells，MSC）可引导乳腺癌DTC进入休眠，并且如果有衰老或其他外源性因素打破MSC内稳态，可进一步打破休眠以及导致乳腺癌骨复发转移[57]。也有研究发现BCC与MSC融合可以诱导休眠[58]。另一项研究则认为BCC是在吞噬MSC后被迫进入休眠[59]。

6 非编码RNA

长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）近年来作为潜在的癌症治疗靶点和肿瘤生物标记物而备受关注。Tivari等率先发现休眠的ER阳性BCC的上皮-间质转化基因被激活[60]。Liu等团队进一步发现BCSC的上皮样和间充质样亚群在肺部表现出不同程度的休眠和致瘤性，LncRNANR2F1-AS1在休眠的间充质样BCSC中上调，通过抑制ΔNp63转录引发肺脏BCC的EMT，降低致瘤性并促进肺部BCC的休眠[61]。LncRNAELEANORS是一组最初在复发性BCC模型中识别出的非编码RNA[62]。Fukuoka等发现ELEANOR仅在ER阳性乳腺癌病例表达，并且ELEANOR阳性乳腺癌患者的晚期复发率增加，经多因素分析表明，ELEANORS是一个独立的复发风险因素；进一步对细胞系、小鼠异种移植物和患者组织的分析表明，ELEANORS上调了干细胞基因CD44的表达，并维持了癌症干细胞的数量，这可能促进肿瘤休眠[63]。Kumar等团队发现LncRNAMALAT1的缺失完全消除了BCC的转移潜力，而MALAT1的过表达可以诱导休眠的BCC苏醒或再激活[64]。一项研究调查显示miR-200c在乳腺癌晚期复发患者样本中高表达，其与乳腺癌幸存者无病生存率降低相关[65]。以上证据阐明了LncRNA和miRNA在DCC觉醒中的重要性，表明这些非编码RNA可能被用作乳腺癌预测性生物标志物或治疗靶点。

7 结语

迄今为止DCC无法通过常规临床手段检测到，故早期发现并有效消除DTC是肿瘤学领域的一个突出挑战。关于当下临床实际工作中如何靶向乳腺癌休眠以减少晚期复发现象，笔者认为可分为两方面：减少进入休眠的BCC数量和阻断DCC觉醒。前者有赖于临床医生更规范积极应用现有乳腺癌初始根治治疗手段，后者要求临床医生更加注重影响乳腺癌休眠的临床和流行病学因素。

利益冲突声明：

所有作者均声明不存在利益冲突。