灯盏细辛基于Psmb8/NF-κB 轴抑制糖尿病肾病大鼠炎症反应

谷 梁,张凤强,王 磊

1.河北省眼科医院内科，邢台 050010；2.秦皇岛军工医院内分泌科，秦皇岛 066000；3.曲阳县人民医院肾内科，保定 073100

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病患者最严重的微血管并发症之一，其特征在于血流动力学和代谢因素的相互复杂作用［1-2］。研究表明，炎症在糖尿病并发症进展中发挥关键作用，抑制炎症反应已成为DN 的潜在治疗策略［3］。β型蛋白酶体亚基8（proteasome subunitβtype 8，Psmb8）为炎症相关基因，其编码的蛋白可与Psmb9 和Psmb10 共同构成免疫蛋白酶体［4］，免疫蛋白酶体则有助于调节促炎细胞因子的产生和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）途径的激活［5］，表明抑制Psmb8/NF-κB 轴可能是实现DN 抗炎的途径之一。灯盏细辛（erigeron breviscapus，EB）为灯盏花的干燥全株，主要活性成分为黄酮类化合物，具有保护神经、保护心脑血管、抗氧化、抗癌及抗炎等药理作用［6］。本研究拟通过构建DN 大鼠模型探讨EB 对DN 大鼠炎症反应的影响及可能的作用机制，以期为DN 治疗机制的研究及药物的选择提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

16580 50 型电泳仪及电泳槽均购自美国Bio-Rad公司；Spectra Max 190 型酶标仪（美国Molecular Devices 公司）；MIK RO 220 型超速低温离心机（德国Hettich 公司）；罗氏卓越精采型血糖仪（德国罗氏公司）；RM2135 型石蜡切片机（德国徕卡公司）；7180 全自动生化分析仪（日本日立公司）。

1.2 试药

灯盏细辛注射液（规格为10 mL，云南生物谷药业股份有限公司）；链脲佐菌素（streptozotocin，STZ，上海源叶生物科技有限公司）；大鼠肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白细胞介素-18（interleukin-18，IL-18）ELISA 试剂盒及Psmb8 抗体均购自北京索莱宝科技有限公司；核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）p65、p-NF-κB p65 抗体均购自美国CST 公司；辣根过氧化物酶标记的二抗（美国Abcam 公司）。

1.3 动物

SPF 级7 周龄雄性SD 大鼠60 只，体质量为（200±20） g，购于西安交通大学动物医学中心，许可证号为SCXK（陕西）2018-006。饲养环境：温度为20～25 ℃，相对湿度为45%～55%，12 h 光照/12 h 黑暗循环，充分给予饮水和饲料。

2 方法

2.1 动物模型的制备

60 只大鼠适应性喂养1 周后，用随机数字表选择10 只作为正常组，剩余大鼠持续4 周给予高脂饮食，正常组普通饲养。4 周后所有大鼠禁食但不禁水12 h，高脂饮食组大鼠一次性腹腔注射STZ 35 mg·kg-1，正常组大鼠腹腔注射等量生理盐水［7］。分别于注射后第3、5、7 天检测高脂饮食组大鼠尾静脉随机血糖，若有≥2 次血糖值≥16.7 mmol·L-1，则糖尿病大鼠成功造模［8］。4 周后收集所有造模大鼠尿液，检测24 h 尿蛋白（urine protein，UPro）。若UPro＞30 mg·24 h-1，则为DN 大鼠造模成功［9］，成功造模41 只。

2.2 分组与干预

成功造模大鼠共41 只，随机剔除1 只后，将剩余大鼠随机分为模型组、EB 低剂量组、EB 中剂量组和EB 高剂量组，每组10 只。EB 低剂量、EB 中剂量和EB 高剂量组分别灌胃EB 20、40、80 mg·kg-1·d-1，正常组和模型组大鼠给予等量生理盐水，持续给药8 周。

2.3 标本采集、血糖与生化指标的检测

给药8 周后，测量大鼠体质量；将各组大鼠分别置于独立代谢笼中，采集所有大鼠24 h 尿液，期间保证无食物残渣污染。将所采集尿液于室温环境下以3 000 r·min-1离心（离心半径为10 cm）10 min，吸取上清液，保存于-80 ℃冰箱中备用，检测UPro。采集尾静脉血，用血糖仪测定空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）。用20 g·L-1戊巴比妥钠2.5 mL·kg-1麻醉大鼠后，取下腔静脉血液，4 ℃静置过夜收集血清，置于-80 ℃冰箱中保存。

取所有大鼠双侧肾脏，用4 ℃的生理盐水冲洗，滤纸吸干后称定质量并计算肾脏指数（kidney index，KI），KI=双侧肾脏质量/大鼠体质量。取左肾置于100 mL·L-1的中性甲醛中固定，做病理检查；右肾取新鲜肾组织100 mg，加生理盐水（1∶9）进行匀浆，以3 500 r·min-（1离心半径为10 cm）离心15 min，取上清液于-80 ℃冰箱保存，用于相关分子检测，剩余右肾组织置于液氮中冻存备用。

2.4 肾组织病理学的观察

组织常规固定、脱水透明及石蜡包埋切片后，切片常规脱蜡入水，用苏木素染细胞核1～2 min，水洗，用10 mL·L-1的盐酸乙醇分化数秒，水洗，用氨水反蓝数秒，用流水冲洗，镜下观察细胞核成蓝色，用伊红染色数秒，水洗，梯度乙醇脱水，用二甲苯透明，用树胶封片。封片后均用光学显微镜采集照片。

2.5 肾功能指标及炎症因子的检测

取一部分血清，用全自动生化分析仪检测血清肌酐（serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平。剩余血清用ELISA 检测TNF-α、IL-1β和IL-8 水平，向酶标板各孔中加入稀释后的上述抗原100 μL，置于37 ℃下孵育90 min。弃上清液后用50 g·L-1胎牛血清封闭40 min。加入对应酶标抗体，用酶标仪在450 nm 波长处测定吸光度，根据各因子的标准曲线计算其水平。

2.6 肾组织Psmb8 和NF-κB p65 mRNA 表达水平的检测

用实时荧光定量聚合酶联反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测Psmb8 和NF-κB p65 的mRNA 表达水平。称定每组大鼠肾组织质量，每10～20 mg 组织加入裂解液300 μL。 充分研磨组织，在匀浆中加入RNase 590 μL 和蛋白酶K 10 μL，混合，于56 ℃孵育20 min，于4 ℃以12 000 r·min-1离心5 min。去除上清液，按照试剂盒说明书提取RNA。用核酸定量仪测定质量浓度。将溶液置于无酶管内，-80 °C 保存。以3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参基因，根据2-ΔΔCt法，用qRT-PCR 试剂盒对每种mRNA 进行实时定量，基因相对表达量=2-ΔΔCt。引物序列见表1。

2.7 肾组织诸项指标蛋白表达量的测定

将肾组织标本从-80 ℃冰箱内取出，称定质量，置于培养皿中，用手术剪剪碎，按照0.1 g·mL-1加入冷Lysis Buffer （Lysis Buffer-磷酸酶抑制剂-PMSF 100∶1∶1），混匀，冰上研磨3 min，转移至预冷的离心管中，于4 ℃以12 000 r·min-1（离心半径为10 cm）离心10 min，提取上清液，BCA 蛋白定量分析，4∶1 加蛋白上样缓冲液，100 ℃变性10 min。SDS-PAGE 蛋白凝胶电泳：制胶，上样，120 V 恒压电泳90 min，PVDF 转膜（200 mA恒流，2 h），用50 g·L-1脱脂牛奶室温封闭2 h，加入一抗Psmb8、NF-κB p65（1∶500）和p-NF-κB p65（1∶500），4 ℃孵育过夜。用TBST 洗涤3 次，加入二抗（1∶5 000），常温下孵育1 h，用增强型化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂显色，用凝胶成像分析系统检测蛋白条带，用软件Image J计算灰度值。

2.8 统计学方法

用SPSS 24.0 软件对数据进行统计学处理，计量结果以（±s）表示，多组间样本均数比较用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 EB 对DN 大鼠FBG 水平及KI 的影响

大鼠FBG 水平及KI 组间比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。与正常组比较，其他4 组大鼠FBG和KI 明显升高（P＜0.05）；与模型组比较，EB 低、中、高剂量组大鼠FBG 和KI 均下降（P＜0.05）；EB低剂量、EB 中剂量和EB 高剂量组诸项指标水平变化呈剂量依赖性（P＜0.05）。见表2。

表2 EB 对DN 大鼠FBG 水平及KI 的影响 （±s，n=10）Tab.2 Effects of EB on FBG and renal weight index in DN rats(±s, n=10)

表2 EB 对DN 大鼠FBG 水平及KI 的影响 （±s，n=10）Tab.2 Effects of EB on FBG and renal weight index in DN rats(±s, n=10)

注：与正常组比较，※P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与EB低剂量组比较，＃P＜0.05；与EB中剂量组比较，▲P＜0.05。

组别正常组模型组EB 低剂量组EB 中剂量组EB 高剂量组FBG/（mmol·L-1）5.31±2.64 24.67±2.27※22.61±2.08※△20.63±1.76※△＃18.81±2.01※△＃▲KI 4.10±0.52 9.04±0.84※7.25±0.56※△6.69±0.59※△＃6.13±0.56※△＃▲

3.2 EB 对大鼠Scr、BUN 及24 hUPro 水平的影响

大鼠Scr、BUN 及24 hUPro 水平组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常组比较，其他4 组大鼠Scr、BUN 及24 hUPro 水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，EB 低、中、高剂量组大鼠Scr、BUN 及24 hUPro 水平降低（P＜0.05）；且EB 低剂量、EB 中剂量及EB 高剂量组诸项指标水平变化呈剂量依赖性（P＜0.05）。见表3。

表3 EB 对DN 大鼠Scr、BUN 及24 h UPro 水平的影响 （±s，n=10）Tab.3 Effects of EB on Scr, BUN and 24-hour UPro levels in DN rats (±s, n=10)

表3 EB 对DN 大鼠Scr、BUN 及24 h UPro 水平的影响 （±s，n=10）Tab.3 Effects of EB on Scr, BUN and 24-hour UPro levels in DN rats (±s, n=10)

注：与正常组比较，※P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与EB低剂量组比较，＃P＜0.05；与EB中剂量组比较，▲P＜0.05。

组别正常组模型组EB 低剂量组EB 中剂量组EB 高剂量组Scr/（μmol·L-1）64.11±9.13 106.98±11.16※96.17±9.87※△86.28±10.53※△＃76.13±10.47※△＃▲BUN/（mmol·L-1）6.68±1.33 16.11±2.22※13.18±2.22※△11.07±2.03※△＃8.89±1.96※△＃▲24 h UPro/（mg·24 h-1）9.80±1.66 55.62±6.73※48.81±7.08※△43.19±3.81※△＃31.47±4.40※△＃▲

3.3 EB 对各组大鼠肾组织形态的影响

HE 染色结果显示，正常组大鼠肾脏结构完整，形状规则，未见炎症细胞浸润；模型组中可见肾小球萎缩，细胞外基质增多，胞浆浸润炎性细胞，间质水肿且有大量炎细胞浸润；与模型组比较，EB 低剂量、EB 中剂量和EB 高剂量组大鼠肾组织系膜细胞增生程度、间质内炎细胞浸润量等病理改变及炎症表象均有不同程度的改善。见图1。

图1 各组大鼠肾脏组织HE 染色结果 （×400）Fig.1 HE staining results of rat kidney tissue in each group (×400)

3.4 EB 对大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-18 含量的影响

大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-18 含量组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常组比较，其他4 组大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-18 含量均升高（P＜0.05）；与模型组比较，EB 低剂量、EB 中剂量和高剂量组大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-18 含量均降低（P＜0.05），且EB 低剂量、EB 中剂量和EB 高剂量组诸项指标水平变化呈剂量依赖性（P＜0.05）。见表4。

表4 EB 对DN 大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和IL-18 含量的影响 （±s，n=10）Tab.4 Effect of EB on the content of TNF-α, IL-1β and IL-18 in serum of DN rats (±s, n=10)

注：与正常组比较，※P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与EB 低剂量组比较，＃P＜0.05；与EB 中剂量组比较，▲P＜0.05。

组别正常组模型组EB 低剂量组EB 中剂量组EB 高剂量组TNF-α/（ng·mL-1）57.81±5.65 132.36±10.45※104.21±8.53※△96.93±6.66※△＃76.29±6.36※△＃▲IL-1β/（ng·mL-1）16.03±1.91 47.37±5.48※41.03±5.28※△35.39±6.02※△＃22.39±2.75※△＃▲IL-18/（ng·mL-1）14.59±1.74 59.67±6.74※45.76±6.19※△36.63±5.64※△＃25.79±2.86※△＃▲

3.5 EB 对Psmb8/NF-κB 轴信号蛋白mRNA 表达量的影响

大鼠肾组织中Psmb8 和NF-κB p65 mRNA 相对表达量组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常组比较，其他4 组大鼠肾组织中Psmb8 和NF-κB p65 mRNA 相对表达量升高（P＜0.05）；与模型组比较，EB 低剂量、EB 中剂量和EB 高剂量组大鼠肾组织中Psmb8 和NF-κB p65 mRNA 相对表达量降低（P＜0.05），且EB 低剂量、EB 中剂量和EB 高剂量组诸项指标水平变化呈剂量依赖性（P＜0.05）。见表5。

表5 EB 对肾脏组织中Psmb8 和NF-κB p65 mRNA 表达量的影响 （xˉ±s，n=10）Tab.5 Effects of EB on Psmb8 and NF-κB p65 mRNA expression in kidney tissue (±s, n=10)

表5 EB 对肾脏组织中Psmb8 和NF-κB p65 mRNA 表达量的影响 （xˉ±s，n=10）Tab.5 Effects of EB on Psmb8 and NF-κB p65 mRNA expression in kidney tissue (±s, n=10)

注：与正常组比较，※P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与EB 低剂量组比较，＃P＜0.05；与EB 中剂量组比较，▲P＜0.05。

组别正常组模型组EB 低剂量组EB 中剂量组EB 高剂量组Psmb8 1.02±0.02 4.31±0.34※3.86±0.35※△2.59±0.11※△＃1.69±0.13※△＃▲NF-κB p65 1.01±0.02 5.61±0.43※4.53±0.15※△3.42±0.12※△＃2.24±0.10※△＃▲

3.6 EB 对大鼠Psmb8/NF-κB 轴信号蛋白表达量的影响

大鼠Psmb8、NF-κB p65 和p-NF-κB p65 蛋白相对表达量组间比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。与正常组比较，其他4 组大鼠肾组织中Psmb8、NFκB p65 和p-NF-κB p65 蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；与模型组比较，EB 低剂量、EB 中剂量和EB 高剂量组大鼠肾组织中Psmb8、NF-κB p65 和p-NF-κB p65 蛋白相对表达量降低（P＜0.05），且EB低剂量、EB 中剂量和EB 高剂量组诸项指标水平变化呈剂量依赖性（P＜0.05）。见图2、表6。

图2 各组大鼠肾脏组织中Psmb8、NF-κB p65 和p-NF-κB p65 蛋白表达电泳图Fig.2 Electrophoresis of protein expression of Psmb8, NF-κB p65 and p-NF-κB p65 in kidney tissue of rats in each group

表6 EB 对肾脏组织相关蛋白表达量的影响 （±s，n=10）Tab.6 Effects of EB on the expression of related proteins in kidney tissue (±s, n=10)

表6 EB 对肾脏组织相关蛋白表达量的影响 （±s，n=10）Tab.6 Effects of EB on the expression of related proteins in kidney tissue (±s, n=10)

注：与正常组比较，※P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与EB 低剂量组比较，＃P＜0.05；与EB 中剂量组比较，▲P＜0.05。

组别正常组模型组EB 低剂量组EB 中剂量组EB 高剂量组Psmb8 0.32±0.05 0.89±0.12※0.68±0.08※△0.47±0.07※△＃0.38±0.05※△＃▲NF-κB p65 0.46±0.08 0.92±0.03※0.64±0.06※△0.92±0.05※△＃0.78±0.10※△＃▲p-NF-κB p65 0.28±0.04 0.62±0.09※0.56±0.07※△0.42±0.08※△＃0.38±0.07※△＃▲

4 讨论

DN 是一种严重的糖尿病（diabetes meltitus，DM）并发症，可引起肾小球硬化和肾间质纤维化［10］，同时也是导致DM 患者死亡伤残的重要原因，并且最终会导致蛋白尿或非蛋白尿型的终末期肾病［11］。DN 的典型表现是早期的肾小球高滤过和蛋白尿，然后是进行性肾功能下降，已成为导致DM 高死亡率的重要因素。针对特定炎症介质（如细胞因子）和细胞内信号通路的DN 抗炎策略已在实验模型中显示出关联性，在一定程度上减少了蛋白尿和肾脏的病理变化［12］。由此可见，靶向炎症对糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）进行治疗，可有效延缓疾病进展，改善疾病症状。

灯盏花有效成分为灯盏乙素、咖啡奎宁酸及原儿茶酸等黄酮类化合物，具有活血化瘀、通经活络及消炎止痛的功效［13］。动物实验表明，灯盏花可减轻DN 大鼠氧化应激反应，从而延缓肾小球硬化［14］。临床研究结果显示，灯盏花可用于辅助治疗2 型DN 患者，有助于抑制炎症反应，减少白蛋白漏出，保护肾功能［15］。在炎症发生、发展过程中，Psmb8/NF-κB轴同样是极其重要的一环，Psmb8 可以作为免疫蛋白酶体的一个亚单位诱导炎症反应［16］；NF-κB 则是炎症反应介导的DN 进展的主要转录因子［17-18］。高糖环境下，在肾小球系膜细胞（mesangial cells，MCs）内经免疫蛋白酶体活化的NF-κB 能够诱导包括IL-18 和TNF-α等炎症因子基因的转录，诱导炎症的发生［19］，Psmb8 能通过构成免疫蛋白酶体而活化NFκB，促进DN 炎症的发生与发展［20］。

本研究从DN 炎症发病机制出发，选取Psmb8/NF-κB 轴作为药物潜在靶点，以下游炎症因子TNFα、IL-1β和IL-18 为标志物，研究EB 对STZ 诱导的DN 大鼠肾脏炎症的抑制作用及其作用机制。结果表明，EB 低剂量、EB 中剂量和EB 高剂量组大鼠FBG、体质量和KI 比模型组表现出明显改善，而且大鼠的Scr、BUN 水平以及24 h UPro 排泄量降低；提取肾组织样本进行染色后，EB 低、中、高剂量组大鼠肾组织的炎症病理改变有所改善；ELISA 检测结果表明，血清中炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-18 的水平亦有所降低。未用EB 干预的模型组大鼠，Psmb8、NF-κB p65 以及p-NF-κB p65 的蛋白表达和Psmb8以及NF-κB p65 mRNA 表达水平均升高，说明在DN 病程中，Psmb8/NF-κB 轴被激活并进一步诱导下游因子的表达，这可能是DN 中炎症发病的原因之一；经EB 干预的实验大鼠通路蛋白和mRNA 的表达水平则相对降低，证实了EB 可通过Psmb8/NF-κB轴对DN 进行抑制，并且此种抑制作用与其降低下游炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-18 的表达水平有关。

综上所述，本研究分别从机体、组织、蛋白和mRNA 4 个角度探讨了EB 对DN 大鼠炎症反应的影响，在对实验结果进行分析后发现，EB 对DN 炎症有一定程度的抑制作用，而且这种作用可能与Psmb8/NF-κB 轴及其下游炎症因子有关，但其具体机制仍待进一步研究。