Plackett-Burman 设计结合Box-Behnken 响应面法筛选草乌甲素纳米乳凝胶贴膏的处方

何雨晓,李丽云,孙文强,丁江生*,周云龙

1.云南中医药大学，昆明 650500；2.云南省药物研究所，昆明 650111；3.云南省中药和民族药新药创制企业重点实验室，昆明 650111

草乌甲素是从毛莨科乌头属植物滇西嘟拉（Aconitum bulleyanumDiels）中分离出的生物碱——滇西嘟拉碱甲（bulleyaconitine A），属于二萜双酯型生物碱，是一种强效镇痛剂和抗炎剂，临床上应用广泛，用于治疗各种原因导致的慢性疼痛、癌性疼痛、类风湿关节炎（rheumatoid arthritis）、骨关节炎、肌纤维炎、颈肩痛、腰腿痛等［1-4］。草乌甲素口服后的首过效应明显，生物利用度低。草乌甲素具有剂量小、药效强等优点，但由于其毒性和刺激性较大，肝脏首过效应较强，因此认为经皮给药是其比较理想的给药途径［5］。

纳米乳是一种潜在的载体系统，与传统剂型相比，纳米乳具有良好的增溶能力和热力学稳定性，可以透过皮肤进行药物的输送［6］。此外，纳米乳具有良好的生物相容性，可以递送亲水性和亲脂性药物，可以解决药物的溶解性低、渗透性低和生物利用度低的问题［7-8］。凝胶贴膏原名巴布剂，是将亲水性基质与原料药混合后均匀涂布于合适的背衬材料上制成的可产生局部作用或全身作用的薄片状外用制剂，对皮肤有良好的生物相容性、亲和性、透气性、耐汗性和追随性，生物利用度高［9］。凝胶贴膏主要用于风湿和类风湿关节炎的治疗，近年逐渐用于治疗支气管疾病、心血管疾病、癌症等，成为经皮给药新剂型的研究热点［10-11］。本研究以纳米乳作为草乌甲素药物载体，以初黏力、持黏力作为评价指标，并且结合凝胶贴膏的外观、皮肤追随性、涂布性、透布状况等感官评价指标，用Plackett-Burman 设计、最陡爬坡实验、Box-Behnken 响应面法优化草乌甲素纳米乳凝胶贴膏的基质处方，以期制备出膏体均匀性好、黏性较高、皮肤追随性好、涂布性优良的凝胶贴膏。

1 仪器与试药

1.1 仪器

PL203 型电子天平（梅特勒托利多公司）；STX1202ZH 型电子天平［奥豪斯仪器（常州）有限公司］；TF2RJ-100-DLZS-SB-ZJD61 型真空乳化搅拌机（温州不富机械有限公司）；MS-H280-Pro 磁力搅拌器（德国赛多利斯集团）；NANO 微射流均质机［诺泽流体科技（上海）有限公司］；ZJ-122-B 型初黏性测试仪（济南格瑞特测试仪器有限公司）；ZJ-050-B 型持黏性测试仪（济南赛成电子科技有限公司）；ZJ-077-B 型小型实验用涂布机（上海锴凯科技贸易有限公司）。

1.2 试药

草乌甲素（云南涞文生物科技有限公司）；油酸（山西晋湘辅料有限公司）；聚氧乙烯40 氢化蓖麻油（RH-40，北京凤礼精求医药股份有限公司）；二乙二醇单乙醚（transcutol P，法国嘉法狮公司）；NP-700（亚什兰集团公司）；PVP-K90（重庆斯泰克瑞登梅尔材料技术有限公司）；酒石酸（国药集团化学试剂有限公司）；高岭土（上海亮江钛白化工制品有限公司）；甘油（西安晋湘药用辅料有限公司）；甘羟铝（陕西天正辅料有限公司）。

2 方法

2.1 草乌甲素纳米乳凝胶贴膏的制备

2.1.1 草乌甲素纳米乳的制备 将草乌甲素溶于油酸，再与乳化剂RH40 和助乳化剂transcutol P 混合，用磁力搅拌器搅拌，并不断滴加纯化水，搅拌1 h，搅拌温度为55 ℃，搅拌速度为1 000 r·min-1。加入高剪切乳化机以一定速度剪切45 次，形成初乳。剪切好的初乳通过微射流均质机以28 000 psi 的压力均质8 次，最终形成草乌甲素纳米乳。

2.1.2 草乌甲素纳米乳凝胶贴膏的制备 取处方量的酒石酸和PVP-K90，加入少量纯化水预先过夜溶胀，置于60 ℃水浴锅中充分溶解，作为A 相；取处方量的甘油、NP-700、甘羟铝、高岭土混合，搅拌均匀，作为B 相；纳米乳作为C 相；先将C 相与A 相混合，混合均匀后，边搅拌边加入B 相中，以约60 r·min-1的速度手动搅拌均匀，立即用涂布机涂布，密封保存。

2.2 凝胶贴膏的评价指标

参考2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）第四部通则及相关文献，以初黏力、持黏力、感官评价的综合评分作为评价指标筛选草乌甲素纳米乳凝胶贴膏的基质处方。

2.2.1 初黏力[1,12]参照《中国药典》2020年版第四部通则0952 第一法，用滚球斜坡停止法测定草乌甲素纳米乳凝胶贴膏的初黏力。板上画有2 条相隔10 mm的水平线，上线为钢球起始位置的标记，下线为凝胶贴膏固定的标记，将凝胶贴膏剪成长为8 cm、宽为5 cm 的片，除去盖膜，上端用双面胶固定在板上2 条水平线的下线位置，膏面向上。调节底座使钢板表面与水平面呈30°倾斜，以从大到小的顺序取钢球从水平线的上线自由滚落。记录凝胶贴膏能黏住的最大钢球号，以所有凝胶贴膏中测得的最大值为100 分，其余以（测得值/最高值）×100 计分。

2.2.2 持黏力[13]取2.1.2 项下4.0 cm×6.5 cm 凝胶贴膏1 片，除去盖膜，以4.0 cm×4.0 cm 为测试面积，黏贴于垂直放置的清洁不锈钢板上，记录凝胶贴膏完全从钢板上脱落的时间，重复测量3 次，取平均值。以脱落时间最长的计为满分（100 分），其余的以（测得值/最长值）×100 计分。

2.2.3 感官评价[14]以透布程度、涂展性、均匀性、皮肤追随性为主观考察指标，各指标的满分均为25 分，总分为100 分。透布程度：肉眼观察凝胶贴膏涂布一定时间后，无透布者为满分（25 分）。涂展性：用涂布机涂布时，膏体不聚集成块或断条，易涂布，为满分（25 分）。均匀性：制备的膏体均匀、无块斑，为满分（25 分）。皮肤追随性：将成型的凝胶贴膏贴于手腕的背部，用力甩10 下不脱落者为满分（25 分），分数依据甩手次数的减少而降低。凝胶贴膏感官评分的具体标准见表1。综合评分标准：以感官评分、初黏力和持黏力的综合评分为评价指标，权重系数分别为0.4、0.5、0.1。综合评分=感官评分×0.4+初黏力×0.5+持黏力×0.1。

表1 凝胶贴膏感官评分的标准Tab.1 Sensory scoring standard of the gel paste

2.4 Plackett-Burman 设计

用单因素预实验筛选各个因素的范围，用Plackett-Burman 设计对所有因素进行12 次实验，以2.1.2项下的综合评分为指标，因素和水平见表2。

表2 Plackett-Burman 设计的因素和水平Tab.2 Factors and levels in Plackett-Burman design

2.5 最陡爬坡实验

以Plackett-Burman 实验结果为依据，确定3 个显著因素以选定爬坡的方向，并选择合理步长，设计出最陡爬坡实验的最佳路径。

2.6 Box-Behnken 优化设计

在Plackett-Burman 实验和最陡爬坡实验结果的基础上，以（A）甘油、（B）酒石酸、（C）纯化水为因素，综合评分作为响应值，用Box-Behnken 设计进行数据分析，因素和水平见表3。

表3 Box-Behnken 设计的因素和水平Tab.3 Factors and levels in Box-Behnken design

2.7 数据分析

做3 次平行实验，用Design Expert 13.0 软件对Plackett-Burman 实验和Box-Behnken 实验进行设计及数据分析。

3 结果

3.1 Plackett-Burman 实验

对表3所列的Packett-Burman实验结果进行方差分析，可以得到回归模型方程：综合评价=68.65-0.216 7A-0.3B+4.92C-3.0D+0.966 7E+1.0F-0.633G+0.433H，R2=0.996 8，表明模型显著，拟合良好。

Plackett-Burman 设计结果见表4 和表5。由表5可知，8 个影响因子的显著性排序为C（甘油）＞D（酒石酸）＞F（纯化水）＞E（PVP-k90）＞G（高岭土）＞H（纳米乳）＞B（甘羟铝）＞A（NP-700），且C（甘油）、D（酒石酸）、F（纯化水）3 个因素在8 个因素中最显著。因此，确定以甘油、酒石酸和纯化水作为最陡爬坡实验的实验因素。

表4 Plackett-Burman 设计结果Tab.4 Results of Plackett-Burman design

表5 Plackett-Burman 实验结果的显著性分析Tab.5 Significance test of the results of Plackett-Burman test

3.2 最陡爬坡实验

最陡爬坡实验设计和结果见表6。由表6 可知，第4组实验的综合评分最高，由此筛选出甘油的用量为35～45 g，酒石酸的用量为0.25～0.35 g、纯化水的用量为35～45 g。

表6 最陡爬坡实验的设计和结果Tab.6 Design and results of the steepest ascent experiment

3.3 Box-Behnken 实验分析

用Design Expert 13.0 软件进行Box-Behnken 数据分析，结果见表7。

表7 Box-Behnken 设计的实验结果Tab.7 Experimental results of Box-Behnken design

3.3.1 模型拟合和方差分析 用Design Expert 13.0软件对表7 中的数据进行二次多元回归并进行方差分析，得到的二次多元回归模型方程为综合评分=93.12+4.237 5A-4.825B+4.712 5C+1.475AB-0.2AC+5.375BC-11.335A2-8.41B2-4.085C2，R2＝0.980 5，表明该模型的拟合度良好，可对凝胶贴膏的性能进行分析和预测。二次回归方差分析的结果见表8。

由表8 可知，模型的整体水平达到极显著水平（P＜0.000 1），表明该二次方程的模型具有极显著意义，失拟值=0.943 1＞0.05，表明失拟项差异无统计学意义，实际值和预测值不拟合发生的概率很低，表明该模型对实验结果预测性好，实验稳定、可靠。模型中A、B、C、BC、A2、B2具有显著性，表明各个自变量与因变量之间不是线性关系，而是相互影响的关系。在各影响因素中，因素B和C对响应值的影响最大，其次是因素A。

各因素对草乌甲素纳米乳凝胶贴膏综合评分影响的响应面图和等高线图见图1。响应面图和等高线图可直观地反映各因素的交互作用对响应值的影响以及最优条件下各因素的取值。由图1 可见，图1-B、图1-C 响应面曲线较陡，表明因素B和C之间具有显著性的交互作用，与方差分析的结果一致。等高线的形状反映了各个影响因素之间交互作用的强弱，图形越趋近于椭圆，表示2 个因素之间的交互作用越具有显著性。由图1 可见，因素B、C之间的交互作用最显著。以响应值最大为优化目标筛选最优的基质处方，得到的最优处方条件为A＝40.877，B＝0.294，C＝42.491，即甘油40.877 g、酒石酸0.294 g、纯化水 42.491 g，综合评分为94.937 分。

图1 各因素对草乌甲素纳米乳凝胶贴膏综合评分影响的响应面图和等高线图Fig.1 Response surface and contour map of various factors to the comprehensive score of bulleyaconitine A nanoemulsion gel paste

3.3.2 验证实验 按照最优处方制备了3 批草乌甲素纳米乳凝胶贴膏，并进行验证实验，结果见图2 和表9。所制备的凝胶贴膏表面平整，无透布现象，皮肤追随性好，黏性适中，综合评分与预测值（94.937 分）接近，表明该方法稳定、可靠，预测性良好。

图2 草乌甲素纳米乳凝胶贴膏外观及涂展性和黏性Fig.2 Appearance， spread and viscosity of kusnezocin A nano emulsion gel paste

表9 验证实验的结果（n=3）Tab.9 Results of the validation test （n=3）

4 讨论

在草乌甲素纳米乳凝胶贴膏基质处方的筛选过程中，由于影响凝胶贴膏基质的因素较多，故需要开展多次实验进行筛选。本研究以单因素实验结合Plakett-Burman 设计、最陡爬坡实验、Box-Behnken响应面法减少了筛选的步骤。Plackett-Burman 设计能用最少的实验次数筛选并确定对结果影响比较显著的因素，避免在后期的优化实验中由于部分因素不显著而浪费实验资源，其已经被广泛应用于化学、质量控制和食品科学等领域［15-16］。响应面法的原理是基于多项式数学关系的生成和响应在实验域上的映射来选择最佳公式。Box-Behnken 设计是一种可用于配方统计优化的发散型RSM 设计。该设计提供了一种比常规剂型优化技术更有效的方法，因为它缩短了实验时间、降低了实验成本［17-18］。与正交实验设计及均匀设计比较，Box-Behnken 设计响应面优化更适合处方配比复杂、各因素之间存在交互作用的凝胶贴膏处方的设计。因此，本研究以Plackett-Burman 设计选择显著因子，以爬陡坡实验筛选出因素范围，以Box-Behnken 设计响应面优化、筛选出最优的处方，用最优处方制备的凝胶贴膏膏体均匀平整，黏性适中，并且可以反复贴揭，没有残留，用涂布机涂布时有很好的涂展性，未出现透布的现象。

在研究的过程中发现以下几个问题：①凝胶贴膏的含水量会影响凝胶贴膏的黏性，通常建议含水量为30%～60%［19］，并且在制剂保存的时候要密封保存，选择合适的包材进行包装，防止其由于过度吸湿或者过度干燥导致膏体的性能发生改变。②纳米乳的添加量对凝胶贴膏的基质也有影响，因为纳米乳本身就具有黏性，纳米乳的添加量过多会导致膏体过黏，无法涂布。③膏体的搅拌时间和搅拌速度是凝胶贴膏制备过程中很重要的影响因素。搅拌时间过长、交联反应过度会导致膏体硬度过大不易涂布［20］；搅拌时间过短、交联反应时间过短，则无法形成胶团；搅拌速度过快，容易造成膏体中的气泡过多，且会导致剪切力过大，使膏体内部各物质的链接被破坏从而导致黏性下降；搅拌的速度过慢，则基质较难混匀［21］。搅拌的时间一般控制在10～20 min，且搅拌时应顺着同一个方向［22］，搅拌时如果出现气泡可以用真空泵或者真空干燥箱去除气泡［23-24］。④交联时环境条件（如温度、相对湿度）也会对膏体性能产生影响。温度高时，膏体相对较软，成形较快，容易混合均匀，但是会影响膏体的黏性并且容易透布；温度低时，膏体搅拌会很困难，并且很难混合均匀，搅拌的温度一般控制在50～60 ℃［25］。