维生素C 片含量测定的HPLC 法及溶出度方法的研究

朱清丽,谭艳萍,李 宁,涂蓉荣

安康市食品药品检验检测中心，安康 725000

维生素C 片是非处方药，主要成分为维生素C（L-抗坏血酸），分子式为C6H8O6，用于预防坏血病，也可用于各种急、慢性传染病及紫癜等的辅助治疗。现行标准《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版二部［1］用滴定法测定其含量，标准中有崩解时限检查项目，但未对溶出度进行控制。用滴定法测定含量虽成本低廉，但灵敏度低，受人为因素影响较大。

溶出度是指活性药物在规定条件下从片剂、胶囊剂或颗粒剂等普通制剂中溶出的速率和程度［2］，药物在体内的吸收和利用效率与药物的溶出度具有直接的关系。体外溶出实验通常被认为可预测药物的体内行为和生物利用度情况［3］，是固体制剂体外工艺控制的重要指标，对评价固体制剂的内在质量尤为重要。目前关于维生素C 片含量测定及溶出度方法研究的报道极少，为了进一步提高检测标准，依据药品质量标准制定相关规范要求［4］，参照普通口服固体制剂溶出度实验技术指导原则［5］，通过查阅文献［6-20］，建立了测定维生素C 片含量的高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）及测定其溶出度的方法，为控制维生素C 片的质量提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-2030 型高效液相色谱仪、岛津色谱工作站、紫外检测器、UV-2600 紫外分光光度计均购自日本岛津公司；Milli-Q Integral 5 纯水/超纯水一体机（默克密理博公司）；SECURA225D-1CEU 电子分析天平［精度十万分之一，赛多利斯仪器（北京）有限公司］；ADFC12AD 全自动溶出取样收集系统（天津市天大天发科技有限公司）；KQ-250DE 超声波清洗器（昆山市超声波仪器厂）。

1.2 试药

维生素C 对照品（批号100425-202105，中国食品药品检定研究院）；维生素C 片（批号220801，四川依科制药有限公司）；维生素C 片（批号220601，山西太原药业有限公司）；维生素C 片（批号2209178010，西安利君制药有限责任公司）；维生素C 片（批号12208291，上海全宇生物科技确山制药有限公司）；维生素C 片（批号22062101，陕西颐生堂药业有限公司）；甲醇（批号WXBD7557V，色谱纯，Sigma-Aldrich 公司）；磷酸二氢钾（批号20201203，国药集团化学试剂有限公司）；磷酸（批号20160914，天津市科密欧化学试剂有限公司）；水为超纯水（自制）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

对照品储备液：取维生素C 对照品20 mg，精密称定，置于100 mL 量瓶中，加0.1 mol·L-1盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。

对照品溶液：精密量取对照品储备液10 mL，置于20 mL 量瓶中，加0.1 mol·L-1盐酸溶液稀释至刻度，制成每1 mL 约含0.1 mg 的维生素C 对照品溶液，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液：取供试品20 片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于维生素C 100 mg），置于100 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1盐酸溶液适量，超声使其溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过；再精密量取续滤液5 mL，置于50 mL 量瓶中，加0.1 mol·L-1盐酸溶液稀释至刻度，制成每1 mL 约含0.1 mg 的供试品溶液，摇匀，作为供试品溶液。

阴性对照溶液：取维生素C 片样品的空白辅料，按处方比例混匀，称取适量按照供试品溶液的制备方法进行制备，作为阴性对照溶液。

2.2 含量测定方法的建立与考察

2.2.1 色谱条件 色谱柱为菲罗门C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.1 mol·L-1磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH 值至2.5）-甲醇（92∶8）；流速为0.8 ml·min-1；检测波长为243 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 μL。

2.2.2 专属性考察 分别精密量取2.1 项下的对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，按照2.2.1 项下色谱条件进行测定，维生素C 的保留时间为5 min，阴性对照溶液无干扰。色谱图见图1。

图1 专属性实验色谱图Fig.1 Chromatograms of specific test

2.2.3 精密度考察 取对照品溶液分别进样6 次，测得峰面积为3 780 805、3 773 593、3 775 101、3 769 007、3 762 395、3 753 851，计算RSD 值为0.26%，表明精密度良好。

2.2.4 线性考察 精密量取对照品储备液1、2、3、4、5、6、7 mL，分别置于10 mL 量瓶中，加0.1 mol·L-1盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，分别制成每1 mL 中约含维生素C 20、40、60、80、100、120、140 μg 的溶液，作为线性考察溶液。分别取上述线性考察溶液进行测定，以峰面积为纵坐标（y）、质量浓度为横坐标（x）进行线性回归，得到回归方程y=37 487.239x-6 860.622（r=0.999 96），结果显示，维生素C 在20～140 μg·mL-1范围内与其峰面积线性关系良好。

2.2.5 重复性考察 取批号为220801 的样品，按照供试品溶液制备方法平行制备6 份溶液，进行测定。6 份供试品含量测定结果为98.72%、98.19%、98.62%、96.96%、97.67%、98.98%，计算得RSD 值为0.77%，表明此方法的重复性良好。

2.2.6 稳定性考察 取批号为220801 的样品，按照2.1 项下方法制备供试品溶液，在室温条件下分别放置0、2、4、6、8、10、12、16、20、24 h 后进行测定，峰面积依次为3 767 112、3 744 892、3 761 589、3 690 364、3 658 509、3 571 162、3 400 033、3 091 082、2 674 056、2 295 303，计算得8、10、12 h 的RSD 值分别为1.28%、2.04%、3.62%，表明维生素C 供试品溶液在8 h 内稳定。

2.2.7 回收率考察 精密称定已知含量的样品（批号为220801）共9 份，分别精密加入已知样品含量80%、100%、120%限度的对照品各3 份，用0.1 mol·L-1盐酸溶液溶解并稀释制成每1 mL约含维生素C 0.1 mg的回收率考察溶液，进行测定并计算。9 组样品平均回收率为100.16%，RSD 值为0.48%。结果见表1。

表1 回收率实验结果Tab.1 Results of recovery test

2.2.8 检测限与定量限 取对照品溶液逐级定量稀释并测定。当S/N 约为10 时测得定量限为0.120 μg·mL-1，当S/N 约为3 时测得检测限为0.034 μg·mL-1。

2.2.9 耐用性实验 用4 种不同品牌色谱柱进行测试，调整柱温（30、35、40 ℃）、流速（0.7、0.8、1.0 mL·min-1），用磷酸调节0.1 mol·L-1磷酸二氢钾溶液pH 值分别为2.45、2.50、2.55，在规定范围内对流动相进行适当调整，经过考察发现上述调整并不影响含量测定结果，表明此方法的耐用性良好。

2.2.10 HPLC 与滴定法测定结果的对比 按现行标准滴定法，取5 个企业的样品测定含量，与建立的HPLC 法检测结果进行对比，用独立样本t检验对滴定法与HPLC 法测定结果进行统计学分析，差异无统计学意义（P＞0.05），表明可以用HPLC 法代替滴定法。见表2。

表2 2 种方法测定样品含量结果的比较Tab.2 Comparison of the content determination between the 2 methods

3 溶出度方法的建立与考察

3.1 色谱条件与测定方法的验证

同2.2 项下条件和方法。

3.2 溶出度方法的建立

3.2.1 溶出方法的选择 篮法和桨法是检测口服固体制剂溶出度最常用的2 种方法。取批号220801的样品以1 000 mL 0.1 mol·L-1盐酸溶液为溶出介质，转速为50 r·min-1，于5、10、15、20、30、45、60 min分别取样进行测定，将篮法、桨法2 种方法的溶出结果进行比较，结果2 种方法测得的结果基本一致，最终选用篮法作为本品的溶出方法。溶出曲线见图2。

图2 篮法与桨法溶出曲线的比较Fig.2 Comparison of dissolution curves between basket method and paddle method

3.2.2 溶出介质的选择 取批号220801 的样品，用篮法，转速为50 r·min-1，分别以水、0.1 mol·L-1盐酸溶液、pH 4.0 醋酸盐缓冲液、pH 6.8 磷酸盐缓冲液各1 000 mL 作为溶出介质，于5、10、15、20、30、45 min 分别取样、测定。通过对比结果发现，维生素C 在水、pH 4.0 醋酸盐缓冲液中易水解且稳定性较差，测得溶出度结果下降较快；在pH 6.8 磷酸盐缓冲液中溶解不理想且不稳定，测得结果低；在记录的色谱图中未出现降解的杂质峰，表明降解产物在检测波长处无吸收；维生素C 在0.1 mol·L-1盐酸溶液中稳定性最好，该介质与人体胃液环境接近，故选择0.1 mol·L-1盐酸溶液作为溶出介质。溶出曲线见图3。

图3 不同溶出介质中溶出曲线的比较Fig.3 Comparison of dissolution curves in different dissolution media

3.2.3 溶出转速及取样时间的选择 取批号220801 的样品，用篮法以0.1 mol·L-1盐酸溶液1 000 mL 为溶出介质，分别选择转速50、75、100 r·min-1进行实验，于5、10、15、20、30、45 min 分别取样、测定，通过结果对比选择转速为50 r·min-1。样品在10 min 后全部溶出并进入平台，按照连续2 个取样时间点的溶出度之差均≤5%的原则，最终选定取样时间点为20 min。溶出曲线见图4。

图4 不同转速溶出曲线的比较Fig.4 Comparison of dissolution curves among different rotational speeds

3.2.4 溶出度的测定结果 取5 个企业的样品，以0.1 mol·L-1盐酸溶液1 000 mL 为溶出介质，转速为50 r·min-1，于5、10、15、20、30、45 min 分别取样、测定，比较溶出曲线。溶出曲线见图5。

图5 不同企业样品溶出曲线的比较Fig.5 Comparison of dissolution curves of samples from different enterprises

3.2.5 滤膜吸附的影响 取对照品溶液和供试品溶液各10 mL，平行2 份，分别用离心法和滤膜过滤（滤液取弃除2 mL 初滤液的续滤液）法进行测定，结果变化不大，表明用滤膜过滤对溶出度结果无影响。

4 讨论

4.1 检测方法的建立

现行标准用滴定法测定含量，虽成本低廉，但灵敏度低，受人为因素影响较大，如滴定时对终点的判断、要求指示剂临用现配、供试溶液中存在的还原剂对碘液消耗造成的误差等，此方法对结构相近的有关物质或其他干扰测定的杂质缺乏选择性，专属性不强。HPLC 法是通过色谱柱进行分离的分析方法，具有灵敏度高、专属性强、重复性好的优点，建立测定维生素C 的HPLC 法，简化了操作程序、大大提高了检测的准确度。

4.2 检测波长的选择

取2.1 项下对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，用紫外分光光度法，分别在200～400 nm 波长范围内进行紫外光谱扫描，图谱显示对照品溶液与供试品溶液在243 nm 波长处均有最大吸收，辅料溶液在243 nm 波长处无吸收。故选择243 nm 为测定波长。

4.3 溶剂的选择

维生素C 在水中易溶解，但其易水解、具有强还原性，而其在酸性介质中由于受空气中氧的氧化速度减慢、生成单钠盐而不发生水解，用酸性溶剂制备溶液以维持其稳定性。现行标准含量测定项下以新沸过的冷水100 mL 与稀醋酸10 mL 的混合液为溶剂，考虑到与新建立溶出度测定方法中的溶出介质保持一致，选择溶剂为0.1 mol·L-1盐酸溶液。

4.4 流动相的选择

先后用0.2 mol·L-1磷酸二氢钾溶液-甲醇（85∶15）、0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液-甲醇（40∶60）、0.1 mol·L-1磷酸二氢钾溶液-乙腈（85∶15）为流动相进行实验，结果均不理想。用0.1 mol·L-1磷酸二氢钾溶液-甲醇（92∶8）分离效果较好。测定结果显示，维生素C 保留时间、理论塔板数、分离度、重复性、拖尾因子结果均满意。

4.5 溶出度测定方法的确定

通过对溶出方法、溶出介质、溶出转速、取样时间及滤膜吸附影响等方面进行考察，确定维生素C 片溶出度测定方法如下：取本品，按照溶出度测定法（《中国药典》2020年版四部附录0931第一法），以0.1 mol·L-1盐酸溶液1 000 mL 为溶剂，转速为50 r·min-1，依法操作，在20 min 时取样。取溶液10 mL，滤过，取续滤液作为溶出度供试品溶液。按照2.2.1 项下色谱条件进行测定，计算溶出度。

4.6 溶液稳定性的讨论

考虑维生素C 在光下不稳定的特性，同时平行进行1 组遮光实验操作并进行测定，其结果无明显变化，故可不用遮光操作。通过稳定性测定，结果显示在8 h 内溶液稳定，10 h 后其峰面积逐渐变小，故在实验过程中要注意控制时间，制备的溶液需在8 h 内完成测定。

通过建立高效液相测定维生素C 含量的HPLC法及新建维生素C 的溶出度方法使其检测结果准确性更高、专属性更强、重复性更好，具有可信、精准的优势，能更有效地对维生素C 片进行质量控制。