黄芩苷对多囊卵巢综合征大鼠颗粒细胞增殖和凋亡的影响

范宏芳,王孜涵,王 莉,马韵翼,钮红丽,翟俊英,姜李乐

1.河南大学附属南阳市第一人民医院生殖医学科，南阳 473000；2.河南省人民医院生殖医学科，郑州 450000

多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是一种常见的内分泌紊乱和代谢异常的妇科疾病，其主要临床表现为持续性无排卵、卵巢多囊样改变、高雄激素血症以及胰岛素抵抗［1］，多数学者认为卵泡内颗粒细胞凋亡可能是其发病的主要原因［2］。研究发现，黄芩苷联合二甲双胍治疗PCOS 大鼠可改善其内分泌紊乱，抑制炎症反应，改善胰岛素抵抗和子宫内膜损伤［3］。另有学者研究发现，黄芩苷联合二甲双胍可逆转PCOS 大鼠卵巢多囊性改变，其机制可能与抑制卵巢颗粒细胞凋亡相关［4］。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路与细胞增殖、分化和凋亡密切相关。研究表明，隐丹参酮通过激活PI3K 途径可改善PCOS 大鼠生殖机能异常［5］。基于以上研究，本实验通过建立PCOS 大鼠模型，探讨黄芩苷对卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响及对PI3K/Akt 信号通路的调节作用。

1 仪器与材料

1.1 仪器

酶标仪（美国Bio-Rad 公司）；流式细胞仪（美国BD 公司）；电泳仪（北京六一仪器厂）；低温高速离心机（美国Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 试药

黄芩苷（质量分数≥98%，批号B20570，上海源叶生物科技有限公司）；脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA，武汉华美科技集团有限公司）；炔雌醇环丙孕酮片（达英-35），拜耳医药保健有限公司）；黄体生成素（luteinizing hormone，LH）、卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）、睾酮（testosterone，T）、雌二醇（estradiol，E2）试剂盒均购自上海碧云天生物科技有限公司；磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、磷酸化磷脂肌醇3-激酶（phospho PI3K，p-PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化蛋白激酶B（phospho Akt，p-Akt）及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）抗体均购自美国Abcam 公司。

1.3 动物

健康清洁级雌性SD 大鼠60 只，8 周龄，体质量为180～200 g，购自北京天诚医药科技有限公司，许可证号为SYXK（京）2016-0047。

2 方法

2.1 造模与分组

PCOS 大鼠模型的制备：随机选取48 只大鼠，按照0.6 g·kg-1的剂量将DHEA 经颈背部皮下注射入大鼠体内，每日1 次，连续20 d，光学显微镜下观察大鼠阴道涂片，若阴道上皮细胞持续角化，动情周期消失即视为模型制备成功［6］。将造模成功的48 只大鼠随机分为模型组、黄芩苷低剂量组、黄芩苷高剂量组和阳性对照组，每组12 只。黄芩苷低剂量组、黄芩苷高剂量组大鼠分别灌胃25、50 mg·kg-1黄芩苷，阳性对照组大鼠灌胃0.339 2 mg·kg-1达英-35，对照组和模型组灌胃等体积生理盐水，每日1 次，连续3 周。

2.2 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

药物干预结束后第2 天，尾静脉采血2 mL，以3 000 r·min-1离心10 min（离心半径为8 cm），根据ELISA 试剂盒说明书将对照品稀释至所需质量浓度，酶标板设置空白孔、对照品孔和待测样品孔，将稀释后的对照品50 μL 置于对照品孔中，待测样品孔中加入稀释液40 μL，再加入待测样品10 μL，37 ℃孵育30 min，洗涤液洗涤5 次，拍板，甩干，加入辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase， HRP）标记的链霉亲和素50 μL，再加入四甲基联苯胺50 μL，反应15 min，置于酶标仪上，在490 nm 波长处测定吸光度（A）值。

2.3 苏木素-伊红（hematoxylin-eosin staining，HE）染色

采血完成后，颈椎脱臼法处死大鼠，取出左侧卵巢组织，置于4 g·L-1多聚甲醛中固定，脱水、包埋、切片后，用苏木素和伊红染液染色，中性树胶封片，置于显微镜下观察大鼠卵巢组织病理学变化。

2.4 颗粒细胞分离

取大鼠右侧卵巢组织，生理盐水冲洗3 次，去除多余脂肪组织，解剖镜下用无菌注射器针头刺破卵巢上的卵泡，释放颗粒细胞，用生理盐水冲洗，200 目筛过滤，以1 500 r·min-1离心5 min，弃上清液，用生理盐水将沉渣重悬，再次离心，上层细胞即为颗粒细胞［7］。

2.5 细胞增殖检测试剂盒（cell Counting Kit-8，CCK-8）

调整细胞密度为106个·mL-1，接种于96 孔板中，加入200 μL 含10 g·L-1胎牛血清的培养基中培养48 h，取出培养板，每孔加入20 μL CCK-8 溶液，培养箱中继续培养4 h，用酶标仪在450 nm 波长处测定A值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（实验组A值/对照组A值）×100%。

2.6 流式细胞仪法

调整细胞密度为106个·mL-1，接种于96 孔板中，加入200 μL 含培养基培养48 h，离心收集细胞，加入结合缓冲液500 μL 将细胞重悬，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）和膜联蛋白V（Annexin V）各5 μL，充分混匀，避光反应15 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.7 蛋白印迹法

收集颗粒细胞，加入放射免疫沉淀法缓冲液（radioimmunoprecipitation assay buffer，RIPA）裂解细胞，在4 ℃条件下以12 000 r min-1离心10 min，收集上清液，二奎啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）试剂盒测定蛋白质量浓度，调整蛋白质量浓度。加蛋白样品，120 V 恒压进行凝胶电泳，0.3 A 恒流进行湿转，洗膜，脱脂奶粉室温封闭，一抗4 ℃孵育过夜，洗膜，二抗室温孵育1 h，洗膜，增强型化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）试剂法显色，Image J 分析条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参灰度值。

2.8 统计学方法

用SPSS21.0 统计学软件分析数据，计量资料均以（±s）表示，多样本计量资料比较用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 血清激素含量测定结果

FSH、E2、LH 和T 含量组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，模型组FSH、E2含量降低，LH、T 含量升高（P＜0.05）；与模型组比较，黄芩苷低剂量组、黄芩苷高剂量组和阳性对照组FSH 和E2 含量升高，LH 和T 含量降低（P＜0.05）；与黄芩苷低剂量组比较，黄芩苷高剂量组和阳性对照组FSH、E2 含量升高，LH、T 含量降低（P＜0.05）；与黄芩苷高剂量组比较，阳性对照组FSH、E2 含量升高，LH、T 含量降低（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血清激素含量的比较 （n=12, ±s）Tab.1 Comparison of serum hormone content in each group （n=12,±s）

表1 各组大鼠血清激素含量的比较 （n=12, ±s）Tab.1 Comparison of serum hormone content in each group （n=12,±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与黄芩苷低剂量组比较，cP＜0.05；与黄芩苷高剂量组比较，dP＜0.05。

项目对照组模型组黄芩苷低剂量组黄芩苷高剂量组阳性对照组FP FSH/（U·L-1）6.09±1.07 2.09±0.82a 3.15±0.81ab 4.22±0.97abc 5.15±0.77abcd 35.833＜0.001 E2/（pmol·L-1）130.71±7.42 36.06±5.01a 55.00±5.98ab 73.77±7.26abc 102.39±12.16abcd 267.404＜0.001 LH/（U·L-1）3.44±0.45 14.94±1.64a 10.63±1.47ab 8.07±0.88abc 5.43±1.01abcd 171.950＜0.001 T/（nmol·L-1）21.70±4.45 147.21±10.20a 118.30±9.18ab 84.23±8.20abc 49.33±8.82abcd 423.011＜0.001

3.2 HE 染色结果

对照组大鼠可见黄体，未见囊状扩张卵泡；模型组大鼠卵巢体积增大，少见黄体，可见囊状扩张卵泡；黄芩苷低剂量组和高剂量组以及阳性对照组大鼠卵巢体积减小，可见黄体，囊状卵泡扩增不明显。见图1。

图1 HE 染色观察卵巢组织的病理变化（×200）Fig.1 The pathological changes of ovarian tissue observed by HE staining (×200)

3.3 CCK-8 法检测结果

细胞存活率组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，模型组细胞存活率降低（P＜0.05）；与模型组比较，黄芩苷低剂量组、黄芩苷高剂量组和阳性对照组细胞存活率升高（P＜0.05）；与黄芩苷低剂量组比较，黄芩苷高剂量组和阳性对照组细胞存活率升高（P＜0.05）；与黄芩苷高剂量组比较，阳性对照组细胞存活率升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠卵巢颗粒细胞存活率的比较（n=12, ±s）Tab.2 Comparison of the survival rate of ovarian granulosa cells in each group (n=12,±s)

表2 各组大鼠卵巢颗粒细胞存活率的比较（n=12, ±s）Tab.2 Comparison of the survival rate of ovarian granulosa cells in each group (n=12,±s)

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与黄芩苷低剂量组比较，cP＜0.05；与黄芩苷高剂量组比较，dP＜0.05。

项目对照组模型组黄芩苷低剂量组黄芩苷高剂量组阳性对照组FP细胞存活率100.00%59.33%±5.35%a 69.08%±8.63%ab 82.04%±4.30%abc 93.16%±2.86%abcd 128.688＜0.001

3.4 流式细胞仪检测结果

细胞凋亡率组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，模型组细胞凋亡率升高（P＜0.05）；与模型组比较，黄芩苷低剂量组、黄芩苷高剂量组和阳性对照组细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与黄芩苷低剂量组比较，黄芩苷高剂量组和阳性对照组细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与黄芩苷高剂量组比较，阳性对照组细胞凋亡率降低（P＜0.05）。见表3、图2。

图2 流式细胞仪检测细胞凋亡率Fig.2 The apoptosis rate measured by flow cytometry

表3 各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率的比较 （n=12，±s）Tab.3 Comparison of apoptosis rate of ovarian granulosa cells of rats in each group (n=12，±s)

表3 各组大鼠卵巢颗粒细胞凋亡率的比较 （n=12，±s）Tab.3 Comparison of apoptosis rate of ovarian granulosa cells of rats in each group (n=12，±s)

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与黄芩苷低剂量组比较，cP＜0.05；与黄芩苷高剂量组比较，dP＜0.05。

项目对照组模型组黄芩苷低剂量组黄芩苷高剂量组阳性对照组FP细胞凋亡率2.36%±0.66%9.18%±0.84%a 8.17%±0.82%ab 6.99%±0.77%abc 4.49%±0.92%abcd 138.887＜0.001

3.5 蛋白印迹法检测结果

p-PI3K 和p-Akt 蛋白相对表达量组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，模型组p-PI3K 和p-Akt 蛋白相对表达量降低（P＜0.05）；与模型组比较，黄芩苷低剂量组、黄芩苷高剂量组和阳性对照组p-PI3K 和p-Akt 蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；与黄芩苷低剂量组比较，黄芩苷高剂量组和阳性对照组p-PI3K 和p-Akt 蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；与黄芩苷高剂量组比较，阳性对照组p-PI3K 和p-Akt 蛋白相对表达量升高（P＜0.05）。PI3K 和p-Akt 蛋白相对表达量组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4、图3。

图3 蛋白表达电泳图Fig.3 Electrophoretic map of protein expression

表4 各组大鼠卵巢组织中蛋白相对表达量的比较 （n=12, ±s）Tab.4 Comparison of relative protein expression levels in ovarian tissues of rats in each group (n=12,±s)

表4 各组大鼠卵巢组织中蛋白相对表达量的比较 （n=12, ±s）Tab.4 Comparison of relative protein expression levels in ovarian tissues of rats in each group (n=12,±s)

注：与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与黄芩苷低剂量组比较，cP＜0.05；与黄芩苷高剂量组比较，dP＜0.05。

项目对照组模型组黄芩苷低剂量组黄芩苷高剂量组阳性对照组FP p-PI3K 0.98±0.04 0.11±0.02a 0.35±0.05ab 0.64±0.06abc 0.89±0.03abcd 877.820＜0.001 PI3K 0.99±0.03 0.98±0.04 0.95±0.05 0.99±0.03 0.95±0.06 2.372 0.065 p-Akt 0.98±0.06 0.10±0.02a 0.42±0.06ab 0.73±0.06abc 0.86±0.05abcd 549.872＜0.001 Akt 0.97±0.05 0.94±0.03 0.94±0.06 0.98±0.03 0.95±0.06 1.566 0.198

4 讨论

卵泡的生长发育是一个精细而复杂的过程，而卵巢颗粒细胞在其中发挥重要作用，在窦前卵泡后期，颗粒细胞出现FSH 受体，FSH 诱导颗粒细胞芳香化酶合成，而芳香化酶可使颗粒细胞将睾酮转化成雌激素，窦卵泡期FSH 受体大量合成，产生大量雌激素，从而促进卵泡发育，形成优势卵泡，但颗粒细胞凋亡可阻止睾酮转变为雌激素，导致雄激素累积，发生高雄激素血症［8］。雄激素的大量积累造成卵泡发育阻滞，优势卵泡的选择出现障碍，大量小窦状卵泡积聚，卵巢发生多囊状改变［9］。由此可见，颗粒细胞凋亡可能是发生PCOS 的重要机制。且SHEN H R 等［10］研究发现，PCOS 大鼠颗粒细胞凋亡率升高，用黄连素处理后可降低细胞凋亡率、抑制炎症反应、改善激素代谢异常。但是颗粒细胞凋亡的具体机制仍待进一步研究。

黄芩苷是一种黄酮类化合物，已有研究表明，黄芩苷可调整PCOS 大鼠激素代谢异常，改善卵巢组织病理学改变和卵泡发育，同时降低炎症反应［11］。黄芩苷在抑制细胞凋亡方面的作用已有很多研究，YU H 等［12］研究发现黄芩苷可通过激活Nrf2/HO-1信号轴有效抑制缺氧诱导的H9C2 细胞凋亡。黄芩苷还可减轻三氧化二砷诱导的人脐静脉内皮细胞氧化损伤和细胞凋亡［13］。本研究HE 染色结果显示，对照组大鼠可见黄体，未见囊状扩张卵泡；模型组大鼠卵巢体积变大，少见黄体，可见囊状扩张卵泡；黄芩苷低剂量组、高剂量组及阳性对照组大鼠卵巢体积变小，可见黄体，囊状卵泡扩增不明显。此外，通过CCK-8 法和流式细胞仪检测黄芩苷对卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响结果表明，与对照组比较，模型组颗粒细胞存活率降低，凋亡率升高；与模型组比较，黄芩苷低剂量组、黄芩苷高剂量组颗粒细胞存活率升高，凋亡率降低。结果表明，黄芩苷可抑制颗粒细胞凋亡、促进增殖。正常生理状况下，卵泡的生长发育通过多种激素的精密调控有序进行，包括T、LH、E2 和FSH，而PCOS 患者由于激素代谢紊乱，通常表现为血清T 和LH 含量升高，而E2 和FSH 含量降低［14-15］。本研究结果显示，与对照组比较，模型组大鼠血清中FSH 和E2 含量降低，而T 和LH 含量升高；黄芩苷治疗后与模型组比较，大鼠血清中FSH 和E2含量升高，而T 和LH 含量降低。表明黄芩苷可改善PCOS 大鼠性激素代谢异常。

PI3K/Akt 通路在细胞凋亡、细胞分化及细胞周期进程中发挥着重要作用［16-17］。XIE F 等［18］研究发现，褪黑素通过激活PI3K-Akt 通路抑制颗粒细胞自噬和凋亡，改善PCOS 大鼠卵巢功能障碍。YU J等［19］研究表明，黄连素通过激活PI3K/AKT 途径对PCOS 的有益作用包括改变血清激素水平、恢复卵巢形态病变、改善胰岛素抵抗、增强细胞活力和抑制颗粒细胞凋亡。此外，葛根素能有效降低PCOS 大鼠血糖及胰岛素水平，改善胰岛素抵抗，且呈浓度依赖性，其作用可能与激活PI3K/AKT/FoxO1 信号通路有关［20］。本研究结果显示，模型组p-PI3K 和p-Akt蛋白表达水平较对照组降低，黄芩苷低剂量组和黄芩苷高剂量组p-PI3K、p-Akt 蛋白表达水平较模型组升高。表明黄芩苷可激活PI3K/Akt 信号通路。

综上所述，黄芩苷可改善PCOS 大鼠性激素代谢紊乱、减轻卵巢病理损伤、促进颗粒细胞增殖、抑制颗粒细胞凋亡，其可能是通过激活PI3K/Akt 信号通路发挥作用的，可为临床治疗PCOS 提供新的研究思路。