基于胎儿游离DNA的地中海贫血无创产前诊断的研究进展

许桂丹综述,邓益斌审校

0 引 言

地中海贫血(地贫)是全球分布最广、累及人群最多、危害性最大的一种单基因病。地贫难治可防,通过产前诊断阻止重型患儿出生是目前国内外公认的首选预防措施。绒毛膜吸取、羊膜腔穿刺和脐静脉血穿刺是目前常用的产前诊断技术,但均属于侵入性操作,除母体细胞污染导致的基因型误诊风险,还有一定流产、宫内感染、胎儿损伤甚至死亡等并发症的风险。孕妇外周血胎儿游离DNA(cell-free fetal DNA,cffDNA)的发现为遗传性疾病的无创产前DNA检测(noninvasive prenatal testing,NIPT)提供了新的途径。近年来,数字PCR、突变序列富集法、分子大小分离法、飞行时间质谱分析和下一代测序(next-generation sequencing, NGS)的发展与应用,使无创产前地贫诊断成为现实,相关技术的进一步发展有望推动其他遗传病无创性产前诊断的应用。本文主要就cffDNA和NGS的地贫NIPT研究进展作一综述。

1 NIPT的发展概况

传统的血清学产前筛查及超声检查检测时间窗窄,且漏诊率和假阳性高,绒毛、羊水和脐静脉血穿刺产前诊断均属于侵入性。一直以来,研究学者们为寻求安全有效的产前诊断技术做了相关大量工作,早在1954年,Chown等[1]研究发现,在失血性贫血胎儿中发现有胎儿红细胞进入母体血液循环。1997年,Lo等[2]从孕妇血浆中检出男性胎儿Y染色体上特异序列,并且发现孕妇血浆cffDNA在孕早期可以检测,其含量明显高于其他胎儿成分,这一重大发现在NIPT史上具有里程碑意义。2008年,Chiu等[3]检测了28例孕妇孕早期和孕中期的血浆样本,测序结果14例21号染色体三体胎儿和14例正常胎儿全部验证,这一重要研究发现开启了NIPT时代。2010年,Lo等[4]证实cffDNA包含整个胎儿基因组,并且以相对恒定的比例与母体基因组共存于孕妇外周血中。利用孕妇外周血中cffDNA进行遗传性疾病的NIPT具有安全、无创、准确率高(有些疾病可达99%以上)、检测时间窗长,检测周期短等优势,而成为产前诊断的研究热点。

2 母体血液中cffDNA的生理特性

孕母血浆中的cffDNA主要来源于凋亡和损伤的胎盘滋养层细胞[4],在孕7周就可检出,其含量随着孕周的增大而增加[5]。cffDNA具有以下特点:①含量低,cffDNA仅占血浆总游离DNA的4%～37%,其余为母亲的游离DNA,母体内cffDNA的百分比也称胎儿浓度(fetal fraction, FF)[6];②片段化,cffDNA片段被降解,平均大小为166bp[7];③半衰期短,cffDNA半衰期仅为4～30min,分娩2h后在母体内迅速清除,不受既往妊娠影响或影响下一胎孕期检测[8];④影响因素,cffDNA受孕妇体质量指数(BMI)、孕早期筛查参数和吸烟状况等因素的影响[9-10]。因此,单基因病的NIPT检测面临着许多技术挑战:①如何检测与高浓度母源性DNA共存的cffDNA?②当cffDNA测出的突变型别中有与孕妇相同的突变时,如何明确胎儿的基因型?③如何运用短片段的cffDNA检测缺失型突变。为克服以上难题,大量的可行性诊断策略不断探索[3-11]。

3 地贫NIPT的研究进展

目前,将cffDNA应用于胎儿染色体非整倍体NIPT的已经成熟应用于临床,针对21、13、18三大染色体非整倍体疾病的检测准确率高达99%以上,具有早期、快速、安全、无创、准确率高等特点[12]。NIPT plus是在21、13、18三大染色体的基础上,增加其他的常染色体非整倍体以及各种微缺失/微重复的检测[13-14]。目前,NIPT还广泛应用于各种单基因遗传病测定,可检测涉及30个基因25种疾病的相关变异[15]。近期的研究表明,在地贫NIPT技术具有较好的应用前景[16-17]。

3.1β-地贫NIPT的研究进展2002年,Chiu等[18]首次报道运用NIPT技术进行地贫产前诊断,利用cffDNA和特异性荧光定量PCR技术,定性检测cffDNA是否存在父源性突变基因型,通过排除父源性突变判断检测对象是否为重型地贫儿,这一研究开启了地贫NIPT的道路。通过检测cffDNA中是否存在父源性突变的方法适用于夫妇双方携带不同β-地贫基因型的情况,未检测出父源性突变则可排除胎儿为重型地贫儿,但如果检出父源性突变位点,胎儿仍需要进行侵入性产前诊断以排除是否同时遗传了母源性突变。当夫妇双方携带的β-地贫基因型相同时,以上方法则不适用。2004年,Ding等[19]报道夫妇携带同种β-地贫基因型的NIPT策略,先筛选出一组与父源突变基因连锁且区别于孕妇的特异性SNP标签,通过检测cffDNA是否存在特异性标签来判断胎儿基因型。如何特异性识别cffDNA是NIPT最大的技术难题[20]。基于Lo等[4]关于cffDNA以相对恒定的比例与母体DNA共存于孕妇外周血的理论,通过不同SNP对β-地贫基因突变位点进行捕获,运用相对突变剂量(relative mutation dosage,RMD)分析或序列概率比检验方法构建单体型相对剂量模型(Relative Haplotype Dosage, RHDO)让NIPT识别母源性基因位点具有可行性。Xiong等[21]利用NGS技术和RMD,对49例已经确诊为父源性β-地贫遗传性的cffDNA样本,鉴定出48例存在母源性等位基因中,有44例(91.7%)与确诊结果一致,有1例为假阳性,3例为假阴性。Saba等[22]运用NGS技术检测37名孕妇的cffDNA,通过构建RHDO模型实现对β-地贫c.118C>T的NIPT。Erlich等[16]结合目标区域捕获测序技术和SNP分析估计FF,综合家系结果,推断胎儿突变基因型,结果证实探针捕获NGS技术在β-珠蛋白异常血红蛋白的NIPT中具有潜在的应用价值。

探针捕获NGS的应用使游离孕妇外周血中低浓度cffDNA的有效识别成为可能,这将极大推动已知突变位点的β-地贫NIPT的发展,但目前仍缺乏高灵敏性和特异性识别cffDNA的生物信息学分析方法,仍需要不断的探索与验证[23-24]。

3.2α-地贫NIPT的研究进展中国南方是地贫高发区,常见的α-地贫突变的类型主要为缺失型,其中以--SEA基因型为主[25-28],我们前期对桂滇黔省际边界民族地区38 812对77 624例育龄夫妇研究表明,α-地贫同型夫妇高达3414对,其中有808对夫妇有可能生育巴氏胎儿,有1849对夫妇有可能生育中间型地贫[27]。有研究人员应用超声技术中的颈项透明层、胎儿心胸比值、胎盘厚度、胎儿大脑中动脉血流速度、胎儿超声心动图等重要指标进行无创性诊断巴氏水肿胎儿的研究[29-32],但是超声技术诊断巴氏水肿胎儿特异性欠佳。因此,准确的α-地贫NIPT技术的发展和应用对我国南方具有重要意义。

缺失型α-地贫往往片段较大,临床上常用gap-PCR、多重连接探针扩增和多重荧光定量PCR等技术进行检测,用以上方法检测高度片段化cffDNA中的大片段缺失存在很大的困难。重型α-地贫患儿的父母均为α-地贫大片段缺失,孕妇外周血浆中最大成分的母源性DNA本身含有1∶1的缺失型片段和野生型序列,父源性等位基因排除法不适用。Yan等[33]用类似Ding等[19]的策略,先筛选和设计出可特异性识别父系遗传的SNP等位基因标签,对已经进行侵入性的67例孕妇进行该策略的评估,结果有33例准确排除了巴氏水肿胎,与传统参考方法完全一致,有2例因溶血而结果不准确,该方法在地贫NIPT的应用上具有良好的应用前景。Ge等[34]结合利用目标序列捕获测序法,通过与正常对照组比较,利用母亲血浆的相对拷贝比,结合二项统计数值R评分(R-score)和L评分(L-score)分析,计算出胎儿拷贝数的信号,在5例--SEA纯合子高风险的胎儿进行验证,结果提示,有1例基因型为--SEA纯合缺失、2例为--SEA杂合缺失,另外两例正常,结果与侵入性产前诊断一致,但是,该方法对FF要求高,加上孕妇血浆中目标区域的捕获特异性远不如基因组的捕获,因此仍需要不断进行条件的优化。Wang等[35]基于cffDNA的原理通过靶向捕获测序和单倍型辅助分析对两个生育重型地贫风险的家庭进行无创产前分析,结果证实与羊水产前诊断结果一致。Chen等[36]招募了59对有重型地贫胎儿风险的夫妇,基于人群数据单倍型分析,成功推断出94.1%胎儿等位基因,通过侵入性产前诊断确认其准确率达99.1%,从而认为基于人群数据单倍型分析的地贫NIPT是一种敏感、快速、经济的策略。

4 结语与展望

无创、准确、安全、简便的产前诊断技术一直是遗传性疾病诊断的方向和目标。NGS技术的发展极大地推动了NIPT的应用。目前,利用孕妇外周血浆中的cffDNA检测胎儿染色体非整倍体项目已经成熟应用于临床。随着技术的不断完善和创新,检测灵敏度不断提高,NIPT技术甚至应用到胎儿表观遗传学、转录组学、基因组学等各方面,利用孕母血浆进行测定获取胎儿表达调控、拷贝数变异及微缺失/微重复,从而实现胎儿疾病早期诊断、干预和避免患病胎儿出生的目的。但是,由于cffDNA 含量较低、地贫基因突变型别的复杂性和多样性、技术操作的繁琐以及数据分析复杂等问题, NIPT应用于地贫产前诊断仍需要大量的探索和实验验证。随着研究的不断深入,检测技术日趋成熟,获取信息日益丰富,测序成本不断降低,在不久的将来地贫无创性产前诊断技术有望应用于临床。