m6A mRNA修饰在心血管疾病中作用的研究进展

陈映泉综述,钟 勇审校

0 引 言

随着医疗技术的进步和人口老龄化的发展,包括心血管疾病(cardiovascular disease,CVDs)在内的多种衰老相关疾病的患病率在世界范围内持续上升。N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修饰是一种在真核生物mRNA内部序列中富集的转录后调控修饰,参与调控包括自噬、炎症、氧化应激、DNA损伤、细胞衰老的多个生物学过程,与CVDs的发生发展密切相关[1-2]。本文就m6A mRNA修饰在心血管衰老、CVD发生发展中的调控作用及其作为CVD生物标志物及治疗靶点的重要价值作一综述。

1 m6A修饰相关蛋白

m6A修饰主要由甲基转移酶、去甲基化酶、结合蛋白共同调节,可调控mRNA的稳定性、剪接、核输出、翻译和降解。甲基化转移酶复合物催化m6A修饰,其核心部分由甲基转移样蛋白3(methyltransferase-like 3,METTL3)、METTL14、Wilms肿瘤蛋白1相关蛋白(wilms tumor 1-associated protein, WTAP)组成,此外,还包含METTL5、METTL16、ZC3H13、ZCCHC4、VIRMA/ KIAA1429、RBM15、RBM15B、CBLL1/ HAKAI等成分。METTL3可作为催化亚基与仅起结构作用的 METTL14形成共定位于核区的异源二聚体,在体内外催化m6A mRNA修饰。WTAP、METTL16、RBM15/RBM15B等虽缺乏催化活性,但可将METTL3-METTL14二聚体招募到核斑点,并将其靶向具有m6A修饰位点的RNA,提高甲基化效率和精确度。

m6A去甲基化酶包括脂肪肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein,FTO)和AlkB同源物5(AlkB Homolog 5,ALKBH5),它们的发现证明了m6A RNA修饰是动态可逆的。m6A结合蛋白包括YTH结构域家族蛋白(YTHDC1/2和 YTHDF1/2/3)和HNRNP家族成员(HNRNPC、HNRNPG和 HNRNPA2B1),此外,还包括胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(insulin-like growth factor-2 mRNA-binding proteins 1/2/3,IGF2BP1/2/3)、FMRP、eIF3、PRRC2A、RBMX、ELAVL1/HuR等,可选择性识别发生m6A修饰的碱基,并激活下游信号通路,通过调控mRNA表达,决定m6A修饰的最终生物学功能[1]。

这些m6A效应蛋白在不同的生物系统中具有多方面的调节功能。METTL3、METTL14、FTO、ALKBH5、YTHDF1、YTHDC1和YTHDC2已被证实与心力衰竭、心肌肥厚、心脏再生、缺血后血管生成、动脉粥样硬化、肺动脉高压等有关。在上述变化过程中,m6A水平往往呈上升趋势。然而,在某些情况下也可观察到下降的趋势[3]。

2 m6A修饰与心血管衰老

衰老是生物随着时间的推移自发的必然过程,各种应激刺激可以加速这一过程,m6A甲基化修饰与之密切相关。有研究发现,早衰细胞的m6A和METTL3水平偏低,过表达METTL3可通过增加MIS12 mRNA的表达挽救衰老表型,IGF2BP2可能通过稳定MIS12 mRNA延缓细胞衰老[4]。此外,有研究发现METTL3/14水平在经历复制性衰老的细胞中逐渐下降,过表达METTL14可减轻复制性衰老和过早衰老[5]。低流体剪切应力(fluid shear stress,FSS) 直接作用于血管壁内皮细胞,是许多CVDs的关键病理因素。一项研究发现,在低FSS作用下,可观察到RBM15和eIF3A的表达上调,m6A差异性表达,这比mRNA表达更早、更敏感。进一步的分析证实,低FSS可能通过改变mTOR、PI3K-AKT、胰岛素和ERRB信号通路的m6A修饰,以及通过降低氧化应激反应中的关键转录因子HIF1a、NFAT5和NFE2L2的甲基化来调节衰老过程[6]。

3 m6A修饰与CVDs

3.1 m6A对CVDs危险因素的影响

3.1.1 高血压FTO在调节能量平衡和新陈代谢的下丘脑中高度表达,因此,FTO变异与高血压风险之间的相关性可能与交感血管舒缩张力的调节有关。有研究发现,内皮细胞FTO过表达可通过减少PGD2的合成,促进动脉肌源性收缩,阻碍血管平滑肌的松弛,从而增加血管阻力,促进高血压的发展[7]。

3.1.2糖尿病糖尿病是CVD的高危因素。多个研究发现,在2型糖尿病患者的m6A呈下降趋势,FTO过表达通过诱导FOXO1、G6PC和DGAT2的mRNA表达参与糖代谢,从而影响小鼠肝脏糖异生;FTO低表达可增加内皮细胞和骨骼肌的AKT的磷酸化,减轻高脂饮食诱导的胰岛素抵抗和葡萄糖耐受不良[7]。此外,有研究发现METTL3低表达可改善葡萄糖耐量和胰岛素敏感性,METTL14低表达可降低β细胞胰岛素的分泌[8]。目前针对m6A修饰在Ⅰ型糖尿病中的作用的研究较少,最近一项研究发现,Ⅰ型糖尿病患者m6A调控因子中METTL3和IGF2BP2的表达明显下调,YTHDC1和HNRNPA2B1的表达明显上调,具体机制有待进一步探讨[9]。

3.1.3血脂异常与肥胖FTO可通过m6A-YTHDF2依赖机制调控CCNA2和CDK2的表达,进而调控有丝分裂克隆扩张,影响前脂肪细胞和脂肪形成的细胞周期进程[10]。FTO-YTHDF2轴也被证明可促进自噬小体的形成和自噬,从而促进脂肪生成[11]。METTL3通过m6A-YTHDF2依赖机制调控CCND1的表达,与FTO在脂肪形成中起相反的作用[12]。有研究证实,在高脂饮食诱导的肥胖型心肌病小鼠中,间断性禁食可通过降低METTL3表达、增加FTO表达,降低m6A甲基化水平,从而减轻心脏脂质沉积和细胞凋亡[13]。

3.2m6A在CVDs中的作用

3.2.1 动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)As的发生与内皮细胞炎症相关。FTO以m6A依赖和YTHDF3介导的方式调节动脉粥样硬化保护基因(eNOS和KLF2)的表达,从而影响内皮细胞的炎症反应[14]。敲除METTL14基因则可使Myd88和IL-6的表达减少,促进M2极化,抑制泡沫细胞形成[15]。此外,有研究表明,METTL3可通过m6A依赖的方式,在YTHDF1、YTHDF2参与下上调NLRP1 mRNA并下调KLF4 mRNA,激活p65/NF-κB通路,从而促进炎症细胞的粘附和As的启动[16]。然而,也有研究发现METTL3可通过加速降解振荡诱导的EGFR mRNA表达,缓解内皮功能障碍,延缓As的进展[17]。

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的增殖、迁移和表型转化也受m6A修饰调控,与As的发生密切相关。FTO过表达可通过促进KLF5的表达,上调糖原合成酶激酶3的下游表达,促进了VSMCs的迁移,并促进了VSMCs从收缩表型向增殖表型的转化,从而促进了动脉粥样硬化、主动脉瘤的发展。相反,WTAP以m6A依赖的方式上调p16的表达,从而抑制了VSMCs的增殖和迁移[18]。

3.2.2腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)AAA以血管壁重塑和进行性扩张为特征,有研究发现AAA中m6A水平显著提高,且高m6A水平会增加AAA破裂的风险。一项研究发现,FTO与动脉瘤性平滑肌细胞和巨噬细胞的浸润有很强的相关性,表明FTO可能在AAA的进展中发挥重要作用[14]。此外,RBM15、WTAP、ALKBH5和IGFBP3均在破裂性腹主动脉瘤中高度表达,并与免疫细胞浸润强相关。RBM15可通过招募WTAP-METTL3-METTLE14 RNA甲基转移酶复合物提高m6A水平,敲低RBM15可降低m6A依赖性的CASP3的表达,抑制人腹主动脉平滑肌细胞凋亡[19]。

3.2.3肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)PAH以肺血管不可逆的重塑为特征。缺氧条件下,大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)中的METTL3和YTHDF2水平显著升高,YTHDF2可识别METTL3介导的m6A修饰的PTEN mRNA,促进PTEN降解,进而激活PI3K/Akt信号通路,导致PASMCs过度增殖[20]。此外,肺泡巨噬细胞中YTHDF2可促进Hmox1 mRNA的降解,敲除YTHDF2可减轻体内外巨噬细胞的交替激活和PASMCs增殖[21]。另外有研究发现,缺氧诱导的PAH小鼠PASMCs中SETD2和METTL14水平升高,特异性敲除SETD2可降低METTL14表达,延缓PAH进展[22]。

3.2.4心肌肥厚与肥厚型心肌病有研究表明,肥厚信号刺激的心肌细胞中m6A甲基化水平明显增加,METTL3过表达可通过丝裂原活化蛋白(MAP3K6,MAP4K5,MAPK14)诱导代偿性心肌肥厚,维持心血管功能的稳定[23]。然而,另外一项研究观察到从扩张心肌病样本中分离的mRNA中m6A甲基化增加,表明敲除METTL3可促进心肌细胞的肥厚和重构,METTL3过表达减弱病理性心肌肥厚[24]。此外,肥厚心肌中YTHDF2的表达增加,从而通过m6A依赖性的MYH7 mRNA降解抑制心肌肥厚[25]。

肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)是一种的遗传相关性心脏病,以不对称心肌肥大为特征。临床表型的异质性表明基因突变并不能说明HCM的全部情况。一项研究表明,YTHDC1和IGFBP3在HCM中高表达,YTHDC1可能影响了肥厚性心肌的有丝分裂和能量代谢,IGFBP3可能参与了心肌组织的免疫微环境和重构[26]。

3.2.5缺血性心脏病自噬异常与缺血性心脏病密切相关。有研究发现,METTL3过表达可通过抑制缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤心肌细胞的自噬通量,促进细胞的凋亡,METTL3敲除小鼠的心肌梗塞减少,心功能改善;FTO、ALKBH5过表达则可出现相反的结果。此外,TFEB是溶酶体自噬的重要调节剂,可通过调节mRNA的稳定性抑制METTL3表达并诱导ALKBH5表达,而METTL3表达反过来也可降低TFEB表达,建立了一个负反馈回路[27-28]。

大多数研究报道甲基化酶在心肌缺血时具有破坏性作用,去甲基化酶具有保护作用。例如,过表达METTL3具有促进心肌纤维化的作用,过表达WTAP促进了内质网应激和细胞凋亡,从而加重心肌I/R损伤[29];敲除METTL14基因抑制了PHLPP2 mRNA修饰并激活Akt-S473,通过PHLPP2调节心肌细胞的生长和凋亡,减轻小鼠心脏急性I/R损伤[30];FTO过表达可增加YAP1 mRNA的稳定性来减轻心肌细胞的凋亡和炎症,ALKBH5过表达可促进心肌细胞增殖,从而改善改善心脏功能[14]。然而,也有研究表明METTL14过表达可通过激活Wnt1/β-catenin信号通路,从而改善心功能,表明甲基化酶也可能具有保护作用[31]。

此外,有研究发现,ALKBH5可通过 ErbB4 mRNA 去甲基化调节成纤维细胞活化以适应缺氧,在心肌梗塞早期对缺氧做出反应并促进疤痕修复。因此,ALKBH5/ErbB4是减少心脏破裂发生的可能治疗靶点[32]。

3.2.6心力衰竭心肌细胞的丧失和收缩能力的缺乏是导致心力衰竭的主要致病机制。有研究表明,FTO过表达可通过调节Mhrt的m6A修饰来抑制缺氧-复氧处理的心肌细胞的凋亡,从而改善心力衰竭。此外,FTO过表达可将Ca2+处理转录本Serca2a去甲基化并增强Serca2a mRNA的稳定性,从而改善心肌细胞的收缩功能,防止心力衰竭的进展。在一个横向主动脉缩窄诱导的心力衰竭模型中发现,心力衰竭时FTO低表达会增加Pgam2 m6A mRNA甲基化并促进其降解,进一步损害心肌组织的糖酵解过程和心脏收缩功能。另外可以观察到,与正常小鼠相比,FTO敲除小鼠术后射血分数明显降低,心室扩张明显增加,从左心室肥厚到心力衰竭的时间显著缩短[33-34]。以上研究证实FTO可以延缓心力衰竭的进展,并为心力衰竭的诊断和治疗策略的发展提供新的途径。

3.2.7心律失常到目前为止,探讨m6A修饰与心律失常的关系的研究相对较少。一项研究表明FTO的整体敲除可导致心功能在交感神经方向的自主神经调节失衡,并可能导致心肌重构[14]。最近一项研究发现,房颤患者心肌组织中RBM15B、IGFBP2、IGFBP3和ALKBH5的表达水平显著升高,而HNRNPC和HNRNPA2B1的表达水平显著降低,不同的m6A修饰模式可能通过影响免疫相关基因NCF2和HCST的表达参与房颤免疫微环境的的调节[35]。

3.2.8心脏瓣膜病主动脉瓣钙化是最常见的心脏瓣膜病之一。有研究发现,METTL3可通过m6A-YTHDF2依赖机制抑制TWIST1表达,从而促进人主动脉瓣间质细胞成骨分化,从而加重瓣膜钙化并导致瓣膜心脏病的发展[36]。

3.3m6A在CVDs中的潜在应用

3.3.1 m6A作为潜在的生物标志物m6A修饰与CVD的发生发展密切相关。m6A对外界刺激的反应快速且及时,这使其具有作为诊断或预测CVD的生物标志物的潜力。此外,m6A修饰的检测技术也在不断创新,这使其具有投入临床使用的可行性。心血管病的病理特征可能在一定程度上反映在外周血表转录组中,有研究表明心肌梗死后血液中FTO及m6A含量与心力衰竭的发展有关,通过血液检测其含量可作为判断心肌梗死预后的指标[37]。

3.3.2m6A作为CVDs的治疗靶点m6A 相关蛋白在特定位点的调控机制的研究为其精准靶向治疗提供了可能。例如,山楂酸可通过调节METTL3介导的m6A修饰抗心肌肥厚[38];三七总皂苷可通过促进WTAP及其下游靶蛋白p16 的表达来抑制VSMCs的增殖和迁移,为评估血管成形术后内膜增生的风险提供了一种潜在的生物标志物,以及一种新的治疗靶点[39]。融合蛋白dm6ACRISPR通过连接催化不同活性的酶到ALKBH5,调控mRNA的稳定性或翻译,特异性地将具有m6A标记的转录本去甲基化,可能用于CVD的基因抑制和细胞功能调控[40]。此外,通过白藜芦醇、姜黄素、间歇禁食和粪便微生物区系移植改善m6A水平也被证实可以有效地减少包括CVDs在内的代谢相关疾病的进展[3]。

4 结语与展望

综上所述,m6A mRNA修饰在心血管衰老及稳定心血管功能中起重要的调控作用并可作为CVDs的潜在生物标志物和治疗靶点。目前m6A在CVDs中的作用机制的阐述大多集中在METTL3、METTL14、FTO和ALKBH5,其他调控因子及各调控因子间的相互作用机制有待进一步研究。m6A修饰在心律失常、Ⅰ型糖尿病中的作用机制的研究也相对较少。其次,虽然在包括缺血性心脏病和心力衰竭在内的大多数CVDs中m6A呈现升高趋势,去甲基化酶过表达可产生保护性作用,但仍存在一些相悖的结论,甲基化酶及去甲基化酶相关激活剂及抑制剂的临床适应症也有待论证。此外,m6A修饰不仅可调控mRNA表达还能调控ncRNA的表达,从而影响生物学功能,其靶点缺乏单一性,可能产生的副作用需要被充分考虑,这限制了m6A效应剂的临床应用。最后,m6A经济方便的检测技术有待进一步研发。因此,距离将m6A mRNA修饰常规应用于临床诊疗中还有很长的路要走。