HPLC-CAD法测定普瑞巴林口服溶液中的对映异构体

钟祥,罗恒真,谢小燕

(江西科睿药业有限公司,江西 赣州 341000)

普瑞巴林口服溶液(Lyrica)于2010年1月在FDA批准上市,其适应症与普瑞巴林胶囊相同,可用于治疗焦虑症、癫痫、神经痛和术后疼痛等,口服溶液批准的优势在于其便于难以吞咽胶囊的患者用药,也便于肾功能损伤及由于肾功能减退可能需要减量的老年患者调整剂量。FDA审评报告中可查询到普瑞巴林口服溶液的处方中含有普瑞巴林、羟苯甲酯、羟苯丙酯、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钠、三氯蔗糖与人造草莓香精,上述原辅料最终均溶解于纯化水中,即成品为水溶液体系,其中普瑞巴林标示量质量浓度为20 mg·mL-1。

普瑞巴林化学名为(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸,含有一个手性碳原子,其对映异构体(R)-3-氨甲基-5-甲基己酸(R-普瑞巴林,R-PRBL)的活性只有S-异构体的十分之一[1],所以需将R-普瑞巴林作为杂质进行控制,建立分析方法进行检查。目前美国药典、欧洲药典与英国药典的普瑞巴林原料药质量标准中均控制R-普瑞巴林含量不得超过普瑞巴林的0.15%,测定方法均为采用Marfey试剂进行柱前衍生化的高效液相色谱法;而相应制剂如普瑞巴林胶囊与普瑞巴林口服溶液等,则未把R-普瑞巴林定入质量标准[2-4]。为保证制剂的安全性和有效性,开展制剂的对映异构体研究仍是必要的,即对映异构体的含量仍是普瑞巴林口服溶液的关键质量属性。

由于普瑞巴林口服溶液组分复杂,抑菌剂和香精中的某些组分也会与Marfey试剂发生副反应,采用手性衍生化试剂进行柱前衍生化再通过液相分离的方法进行检测,方法的回收率与重现性较差,不满足检测要求;而有学者采用正相色谱与蒸发光检测器联用测定普瑞巴林的光学纯度的方法也不适用于含水相的普瑞巴林口服溶液[5];最新收载的文献方法为李晶等发表在《理化检验》中的用HPLC-ELSD测定普瑞巴林原料药中的R-对映异构体方法[6],该方法采用反相液相与键合两性离子手性固定相的色谱柱进行了方法开发与优化,建立了一个快速、有效、灵敏的方法测定原料药中的R-普瑞巴林,把该方法应用于普瑞巴林口服溶液的检测,发现不挥发的辅料峰会干扰R-普瑞巴林出峰,且流动相的背景干扰较大,信噪比不满足要求,故本文参考该方法结合口服溶液的特殊性进行了方法的优化,最终建立了一个反相高效液相色谱与电雾式检测器联用(HPLC-CAD)的方法测定普瑞巴林口服溶液中的R-普瑞巴林,该方法操作简单、专属性强、耐用性良好。

图1为普瑞巴林与R-普瑞巴林结构式。

图1 普瑞巴林(左)与R-普瑞巴林(右)结构式

1 仪器与试药

1.1 试验仪器

Waters AUQUITY Arc高效液相色谱仪(美国Waters公司),CAD检测器(美国Thermo公司);XS105DU型电子分析天平(瑞士梅特勒公司);S220型pH计(瑞士梅特勒公司)。

1.2 试验用药与试剂

甲醇(色谱纯,MERCK);乙醇(色谱纯,MERCK);醋酸铵(LC/MS纯,ACS);醋酸(分析纯,广东光华科技股份有限公司);水为超纯水;普瑞巴林对照品(批号101106-201902,纯度99.7%,中国食品药品检定研究院);R-普瑞巴林对照品(批号31225-A3,纯度99.9%,上海科维化学技术有限公司);普瑞巴林口服溶液[批号20200605,规格2%(473 mL∶9 460 mg),江西青峰药业有限公司];普瑞巴林口服溶液空白辅料溶液(批号20200606,江西青峰药业有限公司)。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件

流动相:0.01 mol/L醋酸铵缓冲液(pH值5.5)-乙醇(20∶80,体积比);色谱柱:CHIRALPAK ZWIX(+),4.0 mm×150 mm,3 μm;柱温为20 ℃;流速为0.5 mL·min-1;进样体积20 μL;检测器蒸发管温度为35 ℃。

2.2 溶液的配制

溶剂为纯化水。

空白辅料溶液:取本品制剂的空白辅料溶液5 mL至10 mL量瓶中,用溶剂稀释至刻度,摇匀。

普瑞巴林定位溶液:取普瑞巴林对照品约50 mg,精密称定,置5 mL量瓶中,加溶剂溶解并稀释至刻度,摇匀。

R-普瑞巴林对照品贮备液:取R-普瑞巴林对照品约15 mg,精密称定,置100 mL量瓶中,加溶剂溶解并稀释至刻度,摇匀。

R-普瑞巴林对照品溶液:精密移取R-普瑞巴林对照品贮备液1 mL,置10 mL量瓶中,用溶剂稀释至刻度,摇匀。

系统适用性溶液:取普瑞巴林对照品约100 mg,精密称定,置10 mL量瓶中,再移入R-普瑞巴林对照品贮备液1 mL,加溶剂溶解并稀释至刻度,摇匀。

供试品溶液:取普瑞巴林口服溶液5 mL,置10 mL量瓶中,用溶剂稀释至刻度,摇匀。

2.3 专属性

取空白溶剂、空白辅料溶液、普瑞巴林定位溶液、R-普瑞巴林对照品与系统适用性溶液,按“2.1”项下色谱条件进样,结果表明R-普瑞巴林峰与普瑞巴林峰已基线分离,空白溶剂峰与空白辅料峰对R-普瑞巴林峰均无干扰,表明方法的专属性良好,典型色谱图见图2。

(a)系统适用性溶液;(b)普瑞巴林定位溶液;(c)空白辅料溶液;(d)空白溶剂图2 典型色谱图

2.4 系统适用性

取“系统适用性溶液”按“2.1”项下色谱条件连续进样6次,考察R-普瑞巴林峰的保留时间与峰面积的相对标准偏差(RSD)及分离度。结果显示连续进样6次,R-普瑞巴林峰的保留时间RSD为0.1%,峰面积RSD为2.5%,分离度均在1.6以上,表明方法连续进样精密度较好。

2.5 检测限

精密移取的“R-普瑞巴林对照品贮备液”1 mL至50 mL量瓶中,用溶剂稀释至刻度,混匀,配制为每1 mL约含R-普瑞巴林3 μg(相对供试品溶液浓度0.03%)的溶液。

按“2.1”项下色谱条件进样,得R-普瑞巴林峰的信噪比(S/N)为9.4,满足大于3的验证要求,表明该方法的最低检测限可至供试品溶液浓度的0.03%,相当于R-普瑞巴林约60 ng,满足普瑞巴林口服溶液对于R-普瑞巴林的检测与控制要求。

2.6 精密度

1)实际样品检测:实验员A和实验员B分别取样各平行配制6份供试品溶液,考察测定所得结果之间的离散程度(RSD);2)加标样品回收率:实验员A和实验员B分别配制6份杂质加标供试品溶液,考察R-普瑞巴林回收率的离散程度(RSD),结果见表1。

杂质加标供试品溶液:取本品5 mL,置10 mL量瓶中,再移入R-普瑞巴林对照品贮备液1 mL,用溶剂稀释至刻度,摇匀。

表1 精密度试验结果

2.7 线性与范围

分别精密移取“R-普瑞巴林对照品贮备液”适量,用溶剂稀释至每1 mL含有R-普瑞巴林约3,7.5,12,15,18,22.5 μg的溶液,分别为限度浓度的20%,50%,80%,100%,120%,150%,按“2.1”项下色谱条件进样,记录色谱图。以峰面积对浓度作回归处理。结果表明R-普瑞巴林的质量浓度在2.99～22.39 μg·mL-1内与峰面积呈线性,相关系数为0.999 1,说明方法线性较好。

2.8 准确度

将已知含量的R-普瑞巴林加入普瑞巴林口服溶液中,制成低(限度的50%)、中(限度的100%)、高(限度的120%)三个浓度,每个水平三份,按拟定的方法测定回收率,结果见表2。

表2 回收率试验结果

2.9 溶液稳定性

将对照品溶液与杂质加标供试品溶液置进样瓶中,室温条件下,分别在第一次进样(0 h)后的第3,6,9,12,18和24 h进样,考察各溶液的稳定性。结果显示在室温条件下,对照品溶液和杂质加标供试品溶液的R-普瑞巴林峰面积在24 h内与0 h 的变化率均在5%以下,表明对照品溶液和供试品溶液在室温24 h内稳定。

2.10 耐用性

考察某些色谱参数或操作有意或无意发生微小改变时,方法依然能稳健执行并获得正确的结果,见表3、4。

表3 耐用性考察的色谱参数

表4 耐用性试验结果

由表3、4可知微小改变拟定方法的色谱条件,对分离度与检测结果均无影响,说明方法耐用性良好。

3 结论

3.1 检测器的选择

普瑞巴林及其对映异构体无共轭双键体系,紫外吸收弱,故选用质量型检测器提高检测灵敏度,与液相匹配的检测器可选用示差折光检测器(RID)、蒸发光散射检测器(ELSD)、电雾式检测器(CAD)与质谱检测器(MS)等,根据日常检测的便利性,选用了灵敏度更高、重现性更好的CAD检测器。

3.2 色谱柱的选择

普瑞巴林有类似氨基酸的结构,对于普瑞巴林和R-普瑞巴林这种两性手性化合物的分离,优先考虑两性离子色谱柱,另普瑞巴林口服溶液含水相,故需选择可适用反相液相的色谱柱。本文考察了两根手性色谱柱,分别为CHIROBIOTIC®T和CHIRALPAK ZWIX(+),两根色谱柱均可使用常规的HPLC流动相(甲醇、乙腈和水等)。其中CHIROBIOTIC®T色谱柱键合相为替考拉宁手性选择剂,对未衍生化的α,β,γ以及环氨基酸等可提供独特的选择性;CHIRALPAK ZWIX(+)色谱柱的填料为硅胶表面键合奎宁(S,S)-ACHSA(*)衍生物(*)反式-2-氨基环己基磺酸,主要用于分离自由氨基酸的两性离子手性固定相,对两性手性化合物,尤其是未经衍生的氨基酸和多肽,有显著的立体选择性。

3.3 流动相体系的选择

在两性离子模式下,所有参与离子交换平衡的物质需要在流动相中较好地解离,流动相首选能提供质子化的溶剂,反相液相色谱中典型的能质子化有机相溶剂主要有甲醇和乙醇,首选甲醇-水与乙醇-水体系进行方法开发。实验发现在甲醇-水与乙醇-水体系下普瑞巴林与R-普瑞巴林未基线分离,故考虑加入缓冲盐体系增加选择性。根据FDA审评报告提到的普瑞巴林pKa分别为4.2与10.6,结合色谱柱的pH值耐受范围,首选缓冲盐的pH值范围为5.2～6.8,缓冲盐在该范围的主要有醋酸盐和磷酸盐,由于选用的CAD检测器优选能挥发的缓冲盐,故选择醋酸盐体系,在考察了0.01 mol·L-1醋酸盐缓冲液-乙醇体系时,发现了更优的分离度,继续优化pH值至5.5时得到分离度最优值,其中CHIROBIOTIC®T色谱柱在普瑞巴林与R-普瑞巴林均在低浓度时(约为30 μg·mL-1)才能有效分离,按普瑞巴林口服溶液中普瑞巴林(100%)与R-普瑞巴林的限度浓度(0.15%)比例配制的系统溶液图谱中,普瑞巴林峰会完全包裹R-普瑞巴林峰,色谱柱不适用,而色谱柱CHIRALPAK ZWIX(+)在方法优化后得到了较好的分离图谱,详见图2典型色谱图。

3.4 验证方法

本文验证的方法为杂质定量分析方法,旨在通过高效液相色谱法测定普瑞巴林口服溶液中含量水平在0.15%以下的R-普瑞巴林。根据ICH Q2(R1)和《中国药典》2020年版四部9101的法规要求及本方法的使用目的[7],本文验证了方法的专属性、系统适用性、灵敏度(检测限)、线性与范围、准确度(回收率)、精密度(重复性和中间精密度)、溶液稳定性和耐用性,各验证项目均符合拟定的验证要求,证明该方法可用于检测普瑞巴林口服溶液中的R-普瑞巴林的含量。当然,该方法的重点在于色谱柱和流动相的结合,在该体系下更换不同的检测系统例如HPLC-ELSD或LC-MS等同样可以用于检测普瑞巴林原料药或者普瑞巴林口服溶液的对映异构体含量。