止痒润肤乳对特应性皮炎小鼠模型皮损组织IL-4、IFN-γ蛋白质与基因表达的影响

刘芳榕 徐翠萍 刘朝圣 成雪 程晓 张语林

〔摘要〕 目的 觀察止痒润肤乳对小鼠特应性皮炎（atopic dermatitis， AD）样模型皮损组织中Janus激酶信号转导子和转录激活子（janus kinase-signal transducer and activator of transcription， JAK-STAT）信号转导通路关键细胞因子白细胞介素-4（interleukin-4， IL-4）、γ干扰素（interferon-γ， IFN-γ）表达水平的影响。方法 将50只SPF级BALB/c小鼠随机分为空白组、模型组、糠酸莫米松软膏组、迪高替尼软膏组、止痒润肤乳组，每组10只。采用２，４-二硝基氯苯（2，4-dinitrochlorobenzene， DNCB）溶液诱导AD样反应，实验过程观察小鼠抓挠行为并进行皮损评分，取材后进行HE染色观察皮损组织病理学改变，采用Real-time PCR法和Western blot法分别测定皮损组织中IL-4、IFN-γ的mRNA表达水平和蛋白含量。结果 与空白组相比，模型组小鼠皮损组织IL-4mRNA和蛋白表达量上升（P<0.05），IFN-γ mRNA和蛋白表达量下降（P<0.05）；与模型组相比，止痒润肤乳组、糠酸莫米松软膏组、迪高替尼软膏组IL-4 mRNA和蛋白表达量减少（P<0.01），IFN-γ mRNA和蛋白表达量升高（P<0.01）；与糠酸莫米松软膏组相比，止痒润肤乳组IL-4 mRNA和蛋白表达量降低（P<0.01）、IFN-γ mRNA和蛋白表达明显升高（P<0.01）；与迪高替尼软膏组相比，止痒润肤乳组IL-4 mRNA 和蛋白表达量差异无统计学意义（P>0.05），IFN-γ mRNA和蛋白表达量升高（P<0.01）。结论 止痒润肤乳对DNCB诱导的AD样症状有明显疗效，其作用机制可能通过抑制JAK-STAT信号转导通路中关键细胞因子IL-4基因表达、上调IFN-γ基因表达，进而减轻炎症反应来实现的。

〔关键词〕 特应性皮炎；止痒润肤乳；JAK-STAT信号通路；白细胞介素-4；γ干扰素；迪高替尼软膏

〔中图分类号〕R275.9         〔文献标志码〕A          〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.01.004

Effects of Zhiyang Runfu Cream on protein and gene expressions of IL-4 and IFN-γ in skin lesions of mice with atopic dermatitis

LIU Fangrong1， XU Cuiping1， LIU Chaosheng2*， CHENG Xue1， CHENG Xiao1， ZHANG Yulin3

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 3. Liuyang Hospital of Chinese Medicine， Liuyang， Hunan 410399， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To observe the effects of Zhiyang Runfu Cream on the expression levels of interleukin-4 （IL-4） and interferon-γ （IFN-γ）， the key cytokines of janus kinase-signal transducer and activator of transcription （JAK-STAT） signaling pathway in skin lesions of mice with atopic dermatitis （AD）. Methods Fifty SPF BALB/c mice were randomized into blank， model， Mometasone Furoate Ointment （MFO）， Delgocitinib Ointment （DO）， and Zhiyang Runfu Cream （ZYRFC） groups， with 10 rats in each group. The AD-like reaction was induced by 2，4-dinitrochlorobenzene （DNCB） solution. The scratching behavior of mice was observed and the condition of skin lesions was scored during the experiment. The AD lesions of mice were peeled back for pathological observation through HE staining. The mRNA expression levels and protein content of IL-4 and IFN-γ in the AD lesions were determined by Real-time PCR and Western blot， respectively. Results Compared with blank group， the mRNA and protein expression levels of IL-4 in the AD lesions of model group increased （P<0.05）， while those of IFN-γ decreased （P<0.05）. Compared with model group， the mRNA and protein expression levels of IL-4 in the AD lesions of ZYRFC， MFO， and DO groups were reduced （P<0.01）， while those of IFN-γ increased （P<0.01）. Compared with MFO group， the mRNA and protein expression levels of IL-4 in the AD lesions of ZYRFC group were lower （P<0.01）， while those of IFN-γ were significantly higher （P<0.01）. Compared with DO group， the mRNA and protein expression levels of IL-4 in the AD lesions of ZYRFC group were not significantly different （P>0.05）， while those of IFN-γ were elevated （P<0.01）. Conclusion Zhiyang Runfu Cream has obvious curative effects on AD-like symptoms induced by DNCB. And its mechanism of action is probably inhibiting the expression of IL-4 gene and increasing the expression of IFN-γ gene in the JAK-STAT signal transduction pathway， and thus alleviating inflammatory reaction.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 atopic dermatitis; Zhiyang Runfu Cream; JAK-STAT signaling pathway; interleukin-4; interferon-γ; Digotinib Ointment

特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）又名“异位性湿疹”“遗传过敏性皮炎”，是一种具有遗传倾向的变态反应性疾病，临床上以具有“特应性”体质的人群反复出现皮肤湿疹样皮损及瘙痒为主要特点。如今全世界受到AD影响的人口至少有2.3亿，80%～90%的病例发病在5岁之前[1]，儿童AD由于发病年龄早、病程持续时间长、临床缺乏特效药物而成为中国家庭经济负担排名第一的儿童皮肤疾病，积极开发有效防治AD的药物具有重大临床价值。近年來，越来越多研究聚焦于Janus激酶信号转导子和转录激活子（janus kinase-signal transducer and activator of transcription， JAK-STAT）信号通路与AD的关系，JAK-STAT信号通路与AD的发生发展密切相关，而白细胞介素-4（interleukin-4， IL-4）和γ干扰素（interferon-γ， IFN-γ）是AD发病机制中的重要调控因子，IL-4和IFN-γ通过JAK-STAT信号通路来转导信号，这一过程可能是引起 AD发病的重要因素。

中医药疗法以整体观念和辨证论治为核心，强调个体化施治，取得了丰富且显著的临床疗效，是临床防治AD的重要手段。止痒润肤乳作为湖南中医药大学第一附属医院自制的纯中药外用复方乳膏，在前期研究中发现其对AD疗效切确，无明显不良反应[2]。本研究着眼于JAK-STAT信号通路，探究止痒润肤乳对AD样小鼠模型的治疗作用及其分子机制，研究结果报道如下。

1 材料

1.1  实验动物

SPF级雌性BALB/c小鼠50只，6周龄，体质量18～20 g，购自湖南长沙斯莱克景达动物公司，合格证号：43072711102946448。饲养于学校SPF级动物实验室，环境洁净，昼夜明暗交替时间10 h/14 h，温度22～26 ℃，相对湿度55%～70%。按照动物伦理学要求善待动物，伦理审批号：ZYFY20201212-07。

1.2  实验药物

止痒润肤乳由医院制剂室提供[3]，批号：20191130。中药组成：生地黄、当归、制首乌、薄荷、苦杏仁、桃仁、红花、地肤子、苦参、大枫子仁、蚕砂、瓜蒌霜、冰片。基质组成：水相包括甘油、苯甲酸钠、氢氧化钾。油相包括硬脂酸、单双甘油酯、白凡士林、液体石蜡、羟苯乙酯。药剂制备按乳剂制备法：（1）取中药薄荷和当归，以水蒸汽蒸馏法提取蒸馏液，并加TW-80乳化剂；（2）取“（1）”所得药渣和其余药材（除冰片外）以乙醇渗漏法提取其中有效成分，制至稠膏状；（3）取配方中油相所含原料高温加热，融化后加入稠膏和冰片搅拌均匀；（4）取3种水相原料将“（1）”制备的混合物加热融化；（5）将以上工序所制两种液体在85 ℃时合并，连续搅拌至冷凝成膏，最后包装为规格50 g/盒的成品制剂。湖北恒安芙林药业股份有限公司提供的规格为10 g的糠酸莫米松软膏（生产批号：200516）；日本烟草及鸟居制药株会社提供的规格为5 g的5%迪高替尼软膏（货号：BCP34832）。

1.3  主要试剂与仪器

2，4-二硝基氯苯（美国Sigma公司，批号：237329）；通用逆转录试剂盒（批号：11141ES60）、Real time PCR荧光定量试剂盒（批号：11201ES08）均购自上海翊圣生物科技有限公司；IL-4抗体（批号：AF5142）、IFN-γ抗体（批号：DF6045）均购自美国Affinity Biosciences公司；羊抗兔-HRP（北京博奥森生物技术有限公司，批号：bs-0295G-HRP）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：PC0020）。

台式低速离心机（上海医疗器械股份有限公司，型号：80-2）；普通PCR仪（西安天隆科技有限公司，型号：Genesy 98T）；实时荧光定量PCR仪（江苏迅睿生物技术有限公司，型号：MA-6000）；核酸检测仪（杭州遂真生物技术有限公司，型号：F-1100）；蛋白marker（赛默飞世尔科技公司，型号：26617）；电泳仪（美国Bio-rad公司，型号：1645070）；电转仪（美国Bio-rad公司，型号：BE6085）；酶标仪（上海倍特生物科技有限公司，型号：800TS）；全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司，型号：5200）。

2 实验方法

2.1  动物分组和造模

实验前，将50只小鼠在SPF级实验室适应性饲养5 d。采用随机数字表法将小鼠分为空白组、模型组、糠酸莫米松软膏组、迪高替尼软膏组、止痒润肤乳组，每组10只。第0天称量每只小鼠体质量并记录，在小鼠背部制备2 cm×3 cm脱毛区域。参考造模方法[4-7]，实验第1～7天，每天将1% ２，４-二硝基氯苯（2，4-dinitrochlorobenzene， DNCB）溶液100 μL均匀涂抹于除空白组外小鼠背部脱毛处皮肤激发AD样反应，第2周开始每周2次使用0.2%DNCB溶液100 μL维持AD样反应，持续3周（规定每周的第3天和第6天进行造模，时间均为上午9点开始），具体造模时间线图如图1。成功的小鼠AD模型可见其背部脱毛处皮肤具有红斑、丘疹、水肿、鳞屑覆盖等症状。

2.2  动物给药

实验第15天起，模型稳定，各组开始给予相应的受试物：糠酸莫米松软膏组每天涂抹糠酸莫米松软膏（100 μg/次，1次/d），迪高替尼软膏组每天涂抹迪高替尼软膏（100 μg/次，1次/d），止痒润肤乳组每天涂抹止痒润肤乳（100 μg/次，1次/d），空白组及模型组均不予以处理，连续14 d。小鼠每天给药时间均为造模后1 h，防止给药时将造模药物擦蹭掉。          2.3  实验取材

实验第29天采取颈部脱臼法处死小鼠，取背部典型部位皮损约1.0 cm×0.5 cm，分离剔除皮下脂肪，用PBS清洗后，将每份标本分为两部分：用于病理观察部分置于离心管中，用4%多聚甲醛浸泡进行固定；用于指标检测部分用离心管装好，冻存在

-80 ℃超低温冰箱备用。

2.4  观测指标与方法

2.4.1  小鼠一般情况观察  （1）小鼠抓挠行为评价：实验第5、10、15、20、25、28天定时统计，小鼠抬起爪持续性搔抓皮损区记为1次，小鼠将爪放下或出现停顿、舔舐后再次抓挠记为第2次，连续搔抓计为1次，统计时间为10 min。观察过程中将小鼠放入透明有孔的聚丙烯盒子内，保持环境安静无人，用摄像机记录以方便统计。（2）皮损状况评分：实验第5、10、15、20、25、28天使用湿疹面积及严重程度指数（eczema area and severity index， EASI）评分评估AD严重程度[8]，并用数码相机拍照记录。①红斑和出血：无为0分，轻微红斑为1分，明显红斑但无出血为2分，明显红斑伴出血为3分；②水肿：无为0分，轻度为1分，中度为2分，重度为3分；③撕裂和糜烂：无为0分，轻度撕裂为1分，明显撕裂但无糜烂为2分，明显撕裂伴糜烂为3分；④干燥和结垢：无为0分，轻度干燥为1分，明显干燥但无结垢为2分，明显干燥伴结垢为3分。为最大限度减少技术差异，在每个实验过程中，都有一名研究人员对治疗视而不见进行测量。

2.4.2  HE染色观察皮损组织病理学表现  将各组小鼠皮损组织经多聚甲醛固定、脱水、包埋切片、核染、着色封片后，在光学显微镜下观察表皮有无角化过度或角化不全、棘层及颗粒层厚度、真皮炎性细胞浸润等情况。

2.4.3  Real time PCR检测皮损组织中IL-4、IFN-γ mRNA表达水平  将适量组织样本完全破碎，应用 TRNzol总RNA提取试剂提取样本RNA，运用4×Hifair■ Ⅲ SuperMix plus进行cDNA反转录，冰上配制反应液后，应用三步扩增程序法PCR扩增程序进行扩增，得到CT值，最终计算2-ΔΔCT值并作图比较。

2.4.4  Western blot检测皮损组织中IL-4、IFN-γ蛋白表达量  将适量皮损组织破碎后采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质浓度，根据目的蛋白的分子量配置相应比例的分离胶和浓缩胶，样本以每孔10 μL的总量进行上样，电泳结束后运用湿转法转膜，室温封闭2 h。进行一抗、二抗孵育后显色曝光，采用全自动化学发光图像分析系统进行曝光。曝光结束后，进行膜洗脱再生、再次封闭2 h，洗涤后进行显色曝光成像，曝光结果使用Image J软件分析灰度值，制作Western blot图表，每个蛋白至少测量3个标本以保证精确。

2.5  统计学分析

统计学分析使用GraphPad Prism 8.0软件进行处理，本实验数据以“ｘ±s”表示。若符合正态性且方差齐性时，采用单因素方差分析，LSD法进行两两比较；方差不齐时采用Dunnett T3 法；否则使用非参数检验。

3 结果

3.1  一般情况观察

3.1.1  小鼠抓挠行为  空白组小鼠抓挠频率在整个实验过程中一直较低；模型组小鼠抓挠频率数值起伏较大，但总体趋势偏高，和空白组相比差异有统计学意义（P<0.01）；3个给药组小鼠随着实验进行，抓挠频率总趋势下降，和模型组相比差异有统计学意义（P<0.05）。详见图2、表2。

3.1.2  皮损状况观察  空白组小鼠在整个实验过程中，被剔除的毛发随着实验进程推进逐渐长出，质地光亮顺泽。模型组小鼠随着实验的推进，DNCB刺激次数增多，皮肤受损程度加重，搔抓次数变频繁，其皮损区域进一步出现抓痕、血痂等损害，皮毛数量、光亮顺泽度也随之降低。糠酸莫米松软膏组小鼠在给予DNCB溶液的第10天背部皮肤出现红斑、水肿、渗出、抓痕等明显炎症反应，在给予糠酸莫米松软膏治疗后，红斑颜色逐渐变浅、水肿减轻，第28天仍有少量抓痕，血痂未完全脱落。迪高替尼软膏组小鼠皮肤在给予治疗后红斑颜色明显变浅、水肿明显减轻，第28天已有部分毛发长出。止痒润肤乳组小鼠在用药后红斑和水肿明显改善，毛发长出，质地柔顺，皮肤光滑，接近空白组和迪高替尼软膏组皮肤颜色。详见图3。

给药治疗后，与模型组相比，糠酸莫米松软膏组、迪高替尼软膏组、止痒润肤乳组皮损评分降低（P<0.05或P<0.01）；与糠酸莫米松软膏比较，迪高替尼软膏组、止痒润肤乳组评分稍低，但差异无统计学意义（P＞0.05）；迪高替尼软膏组和止痒润肤乳组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表3。

3.2  各组小鼠局部皮损组织病理学变化

空白组小鼠皮肤组织表皮层、真皮层结构基本未见明显异常，細胞形态正常，真皮浅层未见明显炎症反应。与空白组相比，模型组皮损可看到明显炎症增生性改变，可见角化过度、棘层肥厚、海绵水肿、真皮血管扩张充血，可见真皮层大量淋巴细胞、嗜酸性粒细胞等炎性细胞浸润，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比，各给药组可见表皮厚度明显减小，表皮层与真皮层的肥大细胞和粒细胞浸润减轻，差异有统计学意义（P<0.05）。与迪高替尼软膏组、止痒润肤乳组比较，糠酸莫米松软膏组小鼠棘层肥厚、海绵水肿、真皮血管扩张充血较严重，差异有统计学意义（P<0.05）。详见图4。

3.3  止痒润肤乳对AD小鼠背部皮损组织IL-4、IFN-γ mRNA表达量的影响

与空白组相比，模型组小鼠皮损组织IL-4 mRNA表达量明显升高（P<0.05），IFN-γ mRNA表达量降低（P<0.05）。与模型组相比，止痒润肤乳组、迪高替尼软膏组、糠酸莫米松软膏组小鼠IL-4 mRNA表达量明显降低（P<0.01），IFN-γ mRNA表达量升高（P<0.01）。与糠酸莫米松软膏组比较，止痒润肤乳组小鼠IL-4 mRNA表达量明显降低（P<0.01）。与迪高替尼软膏组相比，止痒润肤乳组IL-4 mRNA表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。与糠酸莫米松软膏组、迪高替尼软膏组相比，止痒润肤乳组IFN-γ mRNA表达升高（P<0.01）。详见图5。

3.4  止癢润肤乳对AD小鼠背部皮损组织IL-4、IFN-γ蛋白表达水平的影响

与空白组相比，模型组小鼠IL-4蛋白水平明显上升（P<0.05），IFN-γ蛋白水平下降（P<0.05）。与模型组相比，用药干预后3个治疗组小鼠IL-4蛋白含量明显下降（P<0.01），IFN-γ蛋白含量明显上升（P<0.01）。与糠酸莫米松软膏组相比，止痒润肤乳组和迪高替尼软膏组IL-4蛋白含量下降（P<0.01）。与迪高替尼软膏组相比，止痒润肤乳组IL-4蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。与迪高替尼软膏组、糠酸莫米松软膏组相比，止痒润肤乳组IFN-γ蛋白含量明显上升（P<0.01）。详见图6。

4 讨论

特应性皮炎作为目前皮肤科最为常见、治疗难度大的一种慢性炎症性皮肤病，随着对疾病内在机制的深入研究，虽然精准的靶向药物治疗包括免疫抑制剂、生物制剂、磷酸二酯酶-4抑制剂被投入重度AD患者的治疗当中[9]，但其复发风险和不良反应依然显著。既往研究表明，JAK-STAT信号通路作为多种细胞因子的经典信号传导途径，包括4个受体相关激酶和7个蛋白[10]，在AD发病机制中具有重要意义，是AD治疗的新突破点。而IL-4和IFN-γ作为参与机体免疫反应的细胞因子，是AD发病机制中的重要调控因子。IL-4存在两类受体[11]：I型受体只与IL-4结合，在造血细胞中表达；Ⅱ型受体在其他细胞类型中表达。IL-4主要通过JAK-STAT信号通路调节参与免疫调节和炎症反应基因的表达，IL-4Ｒα链上的3个中心酪氨酸残基在受体的刺激下被磷酸化，在STAT6的激活中起重要作用[12]。除此之外，JAK-STAT信号转导通路经过提供IL-4刺激，促使白细胞分化抗原4（cluster of differentiation 4， CD4+）细胞分化为T辅助细胞2（T helper cell 2，Th2）细胞，催化B细胞的成熟，诱导其分化的浆细胞分泌的抗体类别向IgE转换，从而促进组胺释放，加重AD的发生[13]。IFN-γ主要由T辅助细胞1（T helper

cell 1， Th1）细胞表达[14]。经过JAK-STAT信号通路的转导，可抑制Th2细胞因子受体包括IL-4Rα、IL-13Rα1等及其下游信号介质的表达来抑制AD的发生[15]，使由IL-4介导的IgE合成减少，降低IgE受体的表达。除此之外，IFN-γ还能在发挥免疫作用的同时恢复皮肤屏障功能，总之，IFN-γ能够参与皮肤乃至全身的免疫反应中。IL-4和IFN-γ通过JAK-STAT信号通路来转导信号，这一过程可能在AD的发生发展中发挥着关键作用。

中医学认为AD的发病与心脾关系密切，辨证多从湿热内蕴、脾虚湿盛和阴虚血燥等论治。大多数医家认为AD病机是禀赋不耐，后天复感外邪，客于肌表而发病。本研究团队长期关注AD的基础和临床研究，认为AD病因在于先天禀赋不足，复感风、湿、燥邪，蕴于肌表，阻遏气机，郁热化火，基本病机是脾虚津伤燥胜。因此，治疗上应以固护脾胃、养阴润燥为原则，提出“健脾滋阴、培土生金”的AD辨治基本法则，并在此基础上形成了内治以“七味白术散”为主方，外治以医院特色制剂“止痒润肤乳”为主的中医治疗方案，临床疗效肯定。止痒润肤乳作为本院的纯中药乳膏制剂，中药成分为生地黄、当归、制何首乌、薄荷、苦杏仁、桃仁、红花、地肤子、苦参、大枫子仁、蚕砂、瓜蒌霜、冰片。方中君药当归、制首乌滋阴养血，生地黄养阴生津；桃仁、红花活血行气，地肤子、苦参长于祛风除湿止痒，为治疗皮肤湿疮瘙痒要药，大枫子仁性热味辛，长于攻毒除湿，蚕砂温燥祛风，上六味共为臣药；五脏之中肺主皮毛，故加佐药杏仁、瓜蒌霜治肺利气；使药薄荷疏风散邪，冰片凉开芳香促渗。全方有养血滋阴、祛风除湿止痒的功效。

止痒润肤乳在治疗银屑病、老年性瘙痒症、湿疹等疾病的临床作用已被证实[16-18]。本团队在前期研究中，发现止痒润肤乳对儿童AD疗效切确，无明显不良反应[2]，并围绕皮肤微生态影响方面进行了初步基础研究，发现止痒润肤乳具有较好保护皮肤屏障、改善皮肤微生态、抑制角质形成细胞增生的作用[19]。本实验在此基础上，验证了止痒润肤乳对DNCB致敏的BALB/c特应性皮炎小鼠模型免疫功能的影响，是能够抑制皮损组织的IL-4基因表达及其蛋白含量，上调IFN-γ基因表达及其蛋白含量，从而达到抑制炎症、调节免疫的作用，具有良好的科学性及参考价值。

本研究结果显示，止痒润肤乳能够显著改善DNCB致敏的BALB/c AD小鼠瘙痒症状、真皮及棘层炎性细胞浸润情况，降低EASI评分，提示止痒润肤乳对AD模型有切确治疗效果。研究结果还显示，止痒润肤乳能够抑制皮损组织的IL-4基因表达及其蛋白含量，上调IFN-γ基因表达及其蛋白含量，本研究团队从已证实的JAK-STAT信号通路在AD发病机制中具有重要意义，推测止痒润肤乳的疗效作用机制可能是通过调控JAK-STAT信号通路中的关键因子，使Th1/Th2细胞亚群达到平衡，起到免疫调控作用。但本实验对于JAK-STAT 信号通路的研究较为局限，该通路激活还涉及各种蛋白的复杂变化，止痒润肤乳对有关蛋白的特异性调节作用还需大量深层次的实验来验证，未来可聚焦于多种炎症因子检测指标，并与迪高替尼软膏多方面对比治疗效果，或许能够为止痒润肤乳的优势性提供更多实验依据。

基于以上研究结果，本研究团队推测止痒润肤乳可能通过抑制DNCB致敏的AD小鼠皮损组织中IL-4基因表达及其蛋白含量，上调IFN-γ基因表达及其蛋白含量，以达到治疗AD的目的，这在一定程度上揭示了止痒润肤乳通过JAK-STAT信号通路治疗AD的可能作用机制。

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