藁本内酯调控PKD1/HIF-1α/VEGF 通路对心力衰竭大鼠的改善作用

张 岚, 武永新, 张 涛, 王东伟

（郑州大学附属郑州中心医院心血管内科，河南 郑州 450001）

心力衰竭是多种心脏疾病发展的终末阶段，是心血管疾病患者死亡的主要原因。心力衰竭患者临床上主要表现为血液输出量不足、心脏充盈能力低下和全身组织器官灌注不足等症状，其发病率和死亡率均较高［1］。

血管生成是发生心肌缺血后对心肌损伤修复的一种重要补偿机制，因此促进心肌缺血区血运重建成为缺血性心血管疾病治疗和研究的重点关注领域［2］。研究［3］显示：大蒜素通过促进心力衰竭大鼠心肌梗死区血管生成，从而抑制心肌细胞凋亡和心肌纤维化，提高心脏射血功能。

藁本内酯主要来源于当归和川芎等传统中药材，其在呼吸系统、循环系统和免疫功能等方面具有较强的药理作用［4-5］。研究［6］表明：藁本内酯可促进局灶性脑缺血大鼠缺血区血管生成，从而保护缺血性脑损伤和神经功能损伤。蛋白激酶D1（protein kinase D1， PKD1）/缺氧诱导因子1α（hypoxia induced factor-1α，HIF-1α）/血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信号通路在血管生成、稳定和成熟中发挥重要作用［7］。体内外研究［8］表明：藁本内酯对阿霉素所引起的心肌损伤具有保护作用。目前关于藁本内酯对心力衰竭动物模型保护作用的相关研究较少，因此本研究主要探讨藁本内酯是否能够通过调节PKD1/HIF-1α/VEGF 信号通路对心力衰竭大鼠心功能和血管生成产生影响，并分析其具体机制，为心力衰竭的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器SPF 级雄性SD 大鼠60 只，8 周龄，体质量200～220 g，购自北京科兴中维生物技术有限公司，动物使用许可证号：SYXK（京）2020-0054，大鼠自由进食进水，在室温（20±2）℃、湿度50%～80%和12 h 明暗交替环境中适应性饲养3 d 后用于实验。藁本内酯（纯度≥98%，批号：B20492）购自上海源叶生物科技有限公司，PKD1/HIF-1α/VEGF 信号通路阻断剂CID755673（简称CID，批号：S718802） 购自美国Selleck 公司，引物序列由广州锐博生物科技有限公司合成，GAPDH、PKD1、HIF-1α 和VEGF 抗体（批号分别为ab8245， ab234670，ab179483 和ab32152）购自美国Abcam 公司，逆转录试剂盒（批号：BTN63826）购自北京百奥莱博科技有限公司。Vevo2100 型小动物超声系统购自加拿大Visual Son 公司，VentElite 型小动物呼吸机购自北京友诚生物科技有限公司，1645050 型电泳仪购自美国Bio-Rad 公司。

1.2 大鼠心力衰竭模型的制备随机取50 只大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，气管插管，连接小动物呼吸机。在心脏左侧第3～4 肋间开胸，暴露心脏，在左心耳和肺动脉圆锥中间位置找到左冠状动脉前降支并进行结扎，直至左心室壁发白，逐层缝合切口。连接心电图机，出现ST 段抬高说明结扎成功，另10 只大鼠仅在冠状动脉左前降支挂线，不进行结扎，其余操作同上。术后4 周进行心脏超声检查，若左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）＜50%则为造模成功［9］。

1.3 动物分组及给药50 只造模成功大鼠随机分为模型组（12 只）、藁本内酯组（12 只）、CID 组（13 只）和藁本内酯+CID 组（13 只），另10 只仅行冠状动脉左前降支挂线大鼠作为假手术组。从造模成功后第2 天开始，藁本内酯组大鼠尾静脉注射藁本内酯 20 mg·kg-1［10］，其余组大鼠尾静脉注射等量生理盐水，CID组大鼠腹腔注射CID 50 mg·kg-1，藁本内酯+CID 组大鼠腹腔注射CID 50 mg·kg-1后尾静脉注射藁本内酯 20 mg·kg-1，其余组大鼠腹腔注射等量生理盐水，每日1 次，连续4 周。模型组大鼠死亡2 只，CID 组大鼠死亡4 只，藁本内酯+CID 组大鼠死亡1 只，其余组大鼠无死亡。

1.4 心脏超声检查各组大鼠心功能指标给药结束后当日，麻醉所有大鼠，仰卧位固定于鼠板上，进行超声检查，测定各组大鼠LVEF、左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic diameter，LVESD） 和左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）。

1.5 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色法检测各组大鼠心肌梗死面积百分率麻醉后打开大鼠胸腔取心脏，生理盐水冲洗干净，滤干水分，沿左室长轴切成1 mm 薄片并加入TTC 染料，37 ℃水浴箱中水浴20 min，甲醛固定，显微镜拍照，梗死区显示为白色，计算心肌梗死面积百分率。心肌梗死面积百分率=梗死区面积/心肌总面积×100%。

1.6 HE 染色观察各组大鼠心肌组织病理形态表现取各组大鼠梗死区心肌组织，常规脱水、包埋和切片，按照HE 试剂盒说明书进行操作，显微镜下观察各组大鼠心肌组织病理形态表现。

1.7 实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法检测各组大鼠缺血区心肌组织中PKD1、HIF-1α、VEGF 和 CD31 mRNA 表达水平取各组大鼠缺血区心肌组织，组织匀浆至无明显组织块，加入TRIzol 试剂提取组织中的总RNA，采用逆转录试剂盒逆转录为cDNA，以cDNA 为模板，GAPDH 为内参，加入PCR 引物，对所需基因进行PCR 扩增，PCR 扩增条件：94 ℃预变性15 min；95 ℃变性 30 s，60 ℃退火30 s，75 ℃延伸30 s，共40 个循环。采用2-△△Ct法计算各组大鼠缺血区心肌组织中PKD1、HIF-1α、VEGF 和CD31 mRNA 水平，引物序列见表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-qPCR

1.8 蛋白印迹法检测各组大鼠缺血区心肌组织中PKD1、HIF-1α、VEGF 和CD31 蛋白表达水平取各组大鼠缺血区心肌组织，匀浆，加入裂解液置于冰上30 min，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液。BCA 试剂盒测定蛋白浓度，煮沸变性。取总蛋白30 μg 进行SDS-PAGE，当蛋白电泳至分离胶底部时，将蛋白湿转至PVDF 膜上，PVDF 膜用5% 胎牛血清封闭， GAPDH、 PKD1、 CD31、HIF-1α 和VEGF 一抗（1∶1 000） 4 ℃孵育过夜，二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，TBST 洗膜，滴加ECL 发光液进行显影，采用Image J 软件分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH 蛋白条带灰度值。

1.9 统计学分析采用SPSS 21.0 统计软件进行统计学分析。各组大鼠心功能指标、心肌梗死面积百分率、缺血区心肌组织中PKD1、HIF-1α、VEGF 和 CD31 mRNA 及蛋白表达水平均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠心功能指标与假手术组比较，模型组大鼠LVEF 和LVFS 降低 （P＜0.05），LVESD 和LVEDD 增大（P＜0.05）；与模型组比较，藁本内酯组大鼠LVEF 和LVFS 升高（P＜0.05），LVESD 和LVEDD 减小（P＜0.05）；与模型组比较，CID 组大鼠LVEF 和LVFS 降低（P＜0.05），LVESD 和LVEDD 增大（P＜0.05）；与藁本内酯组比较，藁本内酯+CID 组大鼠LVEF 和LVFS 降低（P＜0.05），LVESD 和LVEDD 增大（P＜0.05）；与CID 组比较，藁本内酯+CID 组大鼠LVEF 和LVFS 升高（P＜0.05），LVESD 和LVEDD 减小（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠LVEF、LVFS、LVESD 和LVEDDTab.2 LVEF, LVFS, LVESD, and LVEDD of rats in various groups( ）

表2 各组大鼠LVEF、LVFS、LVESD 和LVEDDTab.2 LVEF, LVFS, LVESD, and LVEDD of rats in various groups( ）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with ligustilide group；○P＜0.05 compared with CID group.

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2.2 各组大鼠心肌梗死面积百分率与模型组（30.93%±1.88%）比较，藁本内酯组大鼠心肌梗死面积百分率（17.35%±1.83%） 降低（P＜0.05）， CID 组大鼠心肌梗死面积百分率（38.88%±2.06%） 升高（P＜0.05）；与藁本内酯组比较，藁本内酯+CID 组大鼠心肌梗死面积百分率（25.70%±5.66%） 升高（P＜0.05）； 与CID 组比较，藁本内酯+CID 组大鼠心肌梗死面积百分率降低（P＜0.05）。

2.3 各组大鼠心肌组织病理形态表现假手术组大鼠肌纤维形态正常，排列整齐，几乎无炎性细胞浸润；与假手术组比较，模型组和CID 组大鼠心肌细胞形态发生改变，细胞间隙增宽，排列紊乱，可见肌纤维断裂，炎性细胞浸润；与模型组比较，藁本内酯组和藁本内酯+CID 组大鼠肌纤维排列相对规整，肌纤维断裂相对较少，炎性细胞数减少。见图1。

图1 各组大鼠心肌组织病理形态表现（HE，×400）Fig. 1 Pathomorphology of myocardium tissue of rats in various groups（HE, ×400）

2.4 各组大鼠缺血区心肌组织中PKD1、HIF-1α、VEGF 和CD31 mRNA 表达水平与假手术组比较，模型组大鼠缺血区心肌组织中PKD1、HIF-1α、VEGF 和CD31 mRNA 表达水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，藁本内酯组大鼠缺血区心肌组织中PKD1、HIF-1α、VEGF 和CD31 mRNA 表达水平升高（P＜0.05），CID 组大鼠缺血区心肌组织中PKD1、HIF-1α、VEGF 和CD31 mRNA 表达水平降低（P＜0.05）；与藁本内酯组比较，藁本内酯+CID 组大鼠缺血区心肌组织中PKD1、HIF-1α、VEGF 和CD31 mRNA 表达水平降低（P＜0.05）；与CID 组比较，藁本内酯+CID组大鼠缺血区心肌组织中PKD1、HIF-1α、VEGF和CD31 mRNA 表达水平升高 （P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠缺血区心肌组织中PKD1、HIF-1α、VEGF 和CD31 mRNA 表达水平Tab.3 Expression levels of PKD1, HIF-1α, VEGF, and CD31 mRNA in ischemia area of myocardium tissue of rats in variousgroups( ）

表3 各组大鼠缺血区心肌组织中PKD1、HIF-1α、VEGF 和CD31 mRNA 表达水平Tab.3 Expression levels of PKD1, HIF-1α, VEGF, and CD31 mRNA in ischemia area of myocardium tissue of rats in variousgroups( ）

*P＜0.05 compared with sham operation group；ΔP＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with ligustilide group；○P＜0.05 compared with CID group.

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2.5 各组大鼠缺血区心肌组织中PKD1、HIF-1α、VEGF 和CD31 蛋白表达水平与假手术组比较，模型组大鼠缺血区心肌组织中PKD1、HIF-1α、VEGF 和CD31 蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，藁本内酯组大鼠缺血区心肌组织中PKD1、HIF-1α、VEGF 和CD31 蛋白表达水平升高（P＜0.05），CID 组大鼠缺血区心肌组织中PKD1、HIF-1α、VEGF 和CD31 蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与藁本内酯组比较，藁本内酯+CID 组大鼠缺血区心肌组织中PKD1、HIF-1α、VEGF 和CD31 蛋白表达水平降低（P＜0.05）；与CID 组比较，藁本内酯+CID 组大鼠缺血区心肌组织中PKD1、HIF-1α、VEGF 和CD31 蛋白表达水平升高（P＜0.05）。见表4 和图2。

图2 各组大鼠缺血区心肌组织中PKD1、HIF-1α、VEGF 和CD31 蛋白表达电泳图Fig. 2 Electrophoregram of expressions of PKD1,HIF-1α, VEGF,and CD31 proteins in ischemia area of myocardium tissue of rats in various groups

表4 各组大鼠缺血区心肌组织中PKD1、HIF-1α、VEGF 和CD31 蛋白表达水平Tab.4 Expression levels of PKD1, HIF-1α, VEGF,and CD31 proteins in ischemia area of myocardium tissue of rats in various groups(）

表4 各组大鼠缺血区心肌组织中PKD1、HIF-1α、VEGF 和CD31 蛋白表达水平Tab.4 Expression levels of PKD1, HIF-1α, VEGF,and CD31 proteins in ischemia area of myocardium tissue of rats in various groups(）

*P＜0.05 compared with sham operation group；△P＜0.05 compared with model group；#P＜0.05 compared with ligustilide group；○P＜0.05 compared with CID group.

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3 讨 论

藁本内酯又名3-丁烯基-4，5-二氢-1（3H）-异苯并呋喃酮，是传统中药当归挥发油的主要活性成分，具有广泛的药理学作用。研究［11］显示：藁本内酯可促进线粒体自噬，具有神经保护作用。藁本内酯对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞损伤具有保护作用，通过Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）下调前列腺癌相关成纤维细胞血管内皮生长因子A （vascular endothelial growth factor A，VEGFA）分泌，抑制肿瘤血管生成［12-13］。但关于藁本内酯在心血管疾病治疗方面的研究较少，因此本研究主要探讨藁本内酯对心力衰竭大鼠心功能和血管生成的影响及其机制。

心脏收缩和舒张功能障碍是心力衰竭患者死亡的主要原因［14］。本研究中心力衰竭大鼠心功能指标检查结果表明：结扎冠状动脉左前降支造成大鼠心功能衰退，而藁本内酯可改善心力衰竭大鼠心功能障碍。本研究中TTC 染色和HE 染色结果显示：藁本内酯可改善心力衰竭大鼠心肌缺血状况，并可减轻大鼠心肌细胞损伤。赵香梅等［15］研究表明：藁本内酯可降低脂多糖导致的心肌细胞炎症反应，抑制心肌细胞凋亡。邹常超等［16］研究显示：理气活血滴丸主要成分之一藁本内酯可通过降低氧化应激和炎症反应治疗心肌缺血再灌注损伤。本研究与以上研究结果具有一致性，即藁本内酯对心肌损伤具有保护作用。

血管内皮细胞增殖是血管生成的基础，研究［17］显示：藁本内酯对糖氧剥夺-复糖氧损伤引起的人脐静脉血管内皮细胞具有保护作用，可抑制血管内皮细胞凋亡和自噬。此外，藁本内酯还具有促进体外模拟缺血环境下血管生成的能力［18］。因此本研究主要通过检测CD31 mRNA 和蛋白表达水平，探讨藁本内酯对心力衰竭大鼠心肌缺血区血管生成能力的影响。CD31 主要表达于血管内皮细胞，是血管生成的重要标志物［19］。本研究结果表明：藁本内酯可促进心力衰竭大鼠心肌缺血区血管生成。

PKD1 是胚胎发育进程中必不可少的调控蛋白，在心肌组织、血管内皮细胞和成纤维细胞中高表达，在介导心肌细胞对缺血反应及缺血后血管生成和心脏重塑进程中发挥重要作用［20］。研究［21］显示：下调PKD1 表达可抑制小鼠动脉内斑块形成和斑块内血管生成。VEGF 主要通过其同源受体血管内皮细胞生长因子受体2 （vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）发出信号控制血管生成，是心血管疾病和癌症的关键生理过程，而PKD1 下调可降低VEGFR2 的表达， 抑制VEGF 诱导的细胞增殖和迁移［22-23］。HIF-1α 在缺氧条件下稳定表达，是细胞内氧平衡的关键调节因子，在缺氧诱导的血管生成、肿瘤发生和炎症反应等方面起关键作用［24］。WANG 等［25］研究发现：丁苯酞注射液通过上调VEGF 和HIF-1α 表达促进慢性心肌缺血大鼠血管生成。香兰素联合己酮可可碱通过上调心肌组织中VEGF 和HIF-1α 表达增强心肌梗死大鼠血管生成［26］。因此为探讨藁本内酯对心力衰竭大鼠心肌缺血区血管生成的具体机制，本研究通过同时给予心力衰竭大鼠藁本内酯和PKD1 阻断剂CID 进行治疗，结果表明：藁本内酯可拮抗CID 对PKD1 的阻断作用，升高PKD1、HIF-1α 和VEGF mRNA 及蛋白表达水平，促进心力衰竭大鼠血管生成。

综上所述，藁本内酯可促进心力衰竭大鼠心肌梗死区血管再生，减轻大鼠心肌损伤，改善心功能指标，其可能是通过激活PKD1/HIF-1α/VEGF 信号通路发挥作用。本研究结果为临床治疗心肌梗死和心肌缺血再灌注损伤提供了理论依据。但本研究仍存在不足之处，今后需进一步研究藁本内酯对血管生成标志物表达的调节作用，进一步分析藁本内酯对心肌细胞和血管内皮细胞损伤的保护作用。

利益冲突声明：

所有作者声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：

张岚参与实验方案设计和论文撰写，武永新参与实验操作，张涛参与数据分析，王东伟参与论文撰写和审校。