基于筒鞘蛇菰治疗高尿酸血症的网络药理学分析及其对高尿酸细胞模型和高尿酸血症模型小鼠的治疗作用

刘 丽, 黄林生, 赵永恒, 曹文洁, 钱永帅, 余惠凡, 李 飞

（1. 湖北医药学院药学院，湖北 十堰 442000；2 湖北医药学院 武当特色中药研究湖北省重点实验室，湖北 十堰 442000; 3. 湖北省十堰市太和医院肝胆胰外科，湖北 十堰 442000）

高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）是由嘌呤代谢紊乱或尿酸（uric acid，UA）排泄减少所引起的代谢性疾病［1］。HUA 是痛风的基础，其UA 病理阈值为405 mmol·L-1，当血清UA 水平高于正常阈值时，尿酸钠晶体沉积于关节，引起关节损伤和炎症反应，从而引发痛风［2-3］。防治痛风和HUA 的主要措施是降低血UA 水平。但目前临床一线降UA 药物不良反应较多，如采用非布司他和别嘌呤醇治疗的患者急性肾功能衰竭发生率较高［4-5］，别嘌呤醇和苯溴马隆可引起不同程度的急性肝损伤［6-7］。因此，发现不良反应少且具有肝肾保护作用的降UA 药物至关重要。筒鞘蛇菰为蛇菰科蛇菰属草本植物，分布于湖北、江西、湖南、四川、广西和云南等地，可全株入药，具有凉血止血、清热解毒、润肺止咳和益肾养阴的功效［8-9］。研究［9-17］显示：筒鞘蛇菰具有镇痛抗炎、抑菌、醒酒保肝、止血散瘀、抗氧化和抗衰老等作用。此外，疏花蛇菰乙酸乙酯部位提取物具有较强的黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）抑制活性，同时可降低氧嗪酸钾诱导的HUA 小鼠UA 水平［18］。目前筒鞘蛇菰降UA 的机制尚不清楚，其有效成分的分子机制如特定靶点和通路等还有待进一步研究。本文作者采用网络药理学方法联合体内外实验验证的方法分析筒鞘蛇菰作用于HUA 的活性成分和潜在作用靶点，探讨其可能的作用机制，为深入研究筒鞘蛇菰治疗HUA 提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 筒鞘蛇菰活性成分和靶点筛选以“筒鞘蛇菰”和“Balanophora involucrata Hook.f.”为关键词，检索台湾中医药数据库（http：//tcm. cmu.edu. tw/review. php）、本草组鉴数据库（http：//herb. ac. cn/） 和化学专业数据库（http：//www.organchem. csdb. cn/scdb/default. asp），同时在中国知网、万方数据库、维普数据库和PubMed 等数据库进行文献检索，获取筒鞘蛇菰化学成分。利用PubChem 数据库（https：//pubchem. ncbi. nlm.nih. gov/） 获取筒鞘蛇菰化学成分2D 分子结构的sdf 格式，将其导入Swiss ADME 数据库（http：//www.swissadme.ch/），根据药代动力学参数以肠胃吸收为“High”作为条件，筛选口服生物利用度较好的活性成分；同时，以Lipinski、Ghose、Veber、Egan 和Muegge 5 种规则进行类药性预测分析，选择预测结果中有2 个及2 个以上为“Yes”的化合物作为活性化合物。此外，将不符合筛选条件但结合文献报道显示具有药理活性的成分予以 纳 入。 将 活 性 成 分 的 sdf 文 件 导 入SwissTargetPrediction 数 据 库 （http：//www.swisstargetprediction.ch/），设定“Homo sapiens”，根据结合概率值排序，选取前15 个预测靶点。通过TargetNet 数据库（http：//targetnet. scbdd.com/）， 以受试者工作特征曲线 （receiver operating characteristic curve，ROC） 下面积（area under curve，AUC） ≥0.7 和可能性＞0.9 为遴选条件进行潜在靶点预测，利用Uniprot（http：//www.uniprot.org）数据库剔除非人源的潜在靶点。

1.2 HUA 疾病靶点和交集靶点获取以“hyperuricemia” 和“gout” 为关键词， 通过DisGeNET 数据库、药物靶点数据库（Therapeutic Target Database， TTD）、 GeneCards 数据库、DrugBank 数据库和人类在线孟德尔遗传（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM） 数据库进行检索、汇总和去重后得到与HUA 相关的靶点。分别将筒鞘蛇菰活性成分靶点及HUA 疾病靶点输入Venny 2.1.0 数据库（https：//bioinfogp. cnb.csic.es/ tools/venny/），得到交集靶点。

1.3 活性成分-预测靶点网络和蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络构建利用Cystoscope 3.7.2 软件构建筒鞘蛇菰活性成分-预测靶点网络。将交集靶点输入到STRING 11.5 数据库中，限定“Organism”为“Homo sapiens”，其余参数选择默认值， 获得PPI 网络， 采用Cytoscape 3.7.2 软件使结果可视化。

1.4 分子对接从PubChem 数据库下载筒鞘蛇菰活性成分的3D 结构，从国际蛋白质结构数据库中（http：//www. rcsb. org/） 下载核心靶点的3D 结构，采用AutoDock TOOLs 进行去水和加氢并分别将其选为配体和受体，利用AutoDock Vina 软件进行对接，采用PyMOL 软件进行可视化。

1.5 基因本体论（Gene Ontology，GO）功能富集和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信号通路富集分析采用R 软件对筒鞘蛇菰治疗HUA 的靶点进行GO 功能富集分析和KEGG 信号通路富集分析，分析筒鞘蛇菰治疗HUA 交集靶点参与的生物学过程和涉及的信号通路。

1.6 细胞、动物、主要试剂和仪器大鼠肾小管上皮NRK-52E 细胞购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。ICR雄性小鼠32 只，体质量18～22 g，购自湖北医药学院实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（鄂）2019-0008，经湖北医药学院动物实验伦理审查委员会批准（2022-实043），小鼠自由饮水进食，分笼饲养，室温23 ℃～25 ℃，相对湿度50%～70%，12 h 明暗交替，适应性喂养3 d。DMEM 培养基和胎牛血清购自美国Gibco 公司，CCK-8 试剂盒购自日本同仁化学研究所， XO 购自美国Solarbio 公司，UA、氧嗪酸钾和次黄嘌呤均购自美国Sigma 公司，UA、肌酐（creatinine，Cr） 和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所， 圣草酚（eriodictyol，EDT）（含量≥98%） 购自陕西省宝鸡市辰光生物科技有限公司，TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，甘油醛-3- 磷酸脱氢酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、蛋白激酶B （protein kinase B，AKT）、磷酸化AKT （phosphorylated AKT， p-AKT） 、 磷 脂 酰 肌 醇 3- 激 酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、磷酸化PI3K（phosphorylated PI3K，p-PI3K）和B 细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗体购自美国CST 公司，Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax） 和 基 质 金 属 蛋 白 酶 9 （matrix metalloproteinase-9， MMP-9） 抗体购自美国Abcam 公司。高效液相色谱（high performance liquid chromatography， HPLC） 仪购自美国Thermo 公司，全波长酶标仪购自美国Molecular Devices 公司。

1.7 CCK-8 法检测各组细胞增殖活性采用含10% FBS 的DMEM 培养基于37 ℃、5% CO2条件下培养NRK-52E 细胞。取对数生长期NRK-52E 细胞调整密度为1×105mL-1，每孔100 μ L 接种于96 孔细胞培养板，待细胞生长融合至80%，血清饥饿12 h，弃去培养液，给药组每孔加入含0.1、0.5、 1.0、 2.0、 5.0、 10.0、 20.0、 50.0 和100.0 μmol·L-1EDT 的培养液，同时设置空白对照组和溶剂对照组，每组6 个复孔。培养24 h 后，弃去培养液，每孔加入100 μL 含10% CCK-8 的完全培养液，检测各组细胞于波长450 nm 处的吸光度（A）值，并计算各组细胞增殖活性。细胞增殖活性=（实验组A 值-空白对照组A 值）/（溶剂对照组A 值-空白对照组A 值）。

1.8 建立腺苷诱导的高尿酸细胞模型取对数生长期NRK-52E 细胞接种于24 孔细胞培养板中培养24 h，设置空白对照组、空白给药组、模型组和不同浓度（2、10 及50 μmol·L-1） EDT 组，血清饥饿24 h，同时预给药。空白对照组和模型组细胞更换含2.5 μmol·L-1腺苷的无血清培养液，空白给药组和不同浓度EDT 组细胞更换含2.5 μmol·L-1腺苷和不同浓度EDT 的无血清培养液，24 h 后，除空白对照组和空白给药组外，其余各组细胞每孔加5 U·mL-1XO 1 μL，6 h 后收集各组细胞上清液进行检测。

1.9 HPLC 法检测各组细胞中UA 水平色谱柱为Agilent-ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为95%缓冲盐水溶液（0.52 mmol·L-11-戊烷磺酸钠和0.2 mmol·L-1磷酸一钾，pH 4.0）-5%乙腈，流速1.0 mL·min-1，检测波长254 nm，柱温40 ℃，进样量1 μL。精密称取对照品UA 1.00 mg，加0.02 mol·L-1NaOH 溶解并定容至1 mL，制成1 g·L-1UA 对照品溶液，混匀，0.45 μm微孔滤膜滤过。 用超纯水稀释至100.000 0、50.000 0、25.000 0、12.500 0、6.250 0、3.125 0 和1.562 5 mg·L-1共7 个浓度，HPLC 法检测，以UA浓度为横坐标，出峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归。收集各组细胞培养上清液，4 ℃、12 000 g 离心15 min 后取上清待测。

1.10 制备HUA 小鼠模型和药物干预SPF 级ICR 雄性小鼠随机分为空白对照组、空白给药组、模型组和EDT（100 mg·kg-1） 组，每组8 只。模型组和EDT 组小鼠采用次黄嘌呤（300 mg·kg-1）联合氧嗪酸钾（300 mg·kg-1）连续腹腔注射7 d 制备HUA 小鼠模型［19］。空白对照组小鼠灌胃给予生理盐水，空白给药组和EDT 组小鼠灌胃给予100 mg·kg-1EDT，连续14 d，包括7 d 预给药。末次灌胃给药2 h 后，摘各组小鼠眼球取血。上述各组小鼠灌胃和腹腔注射给药剂量均为20 mL·kg-1。

1.11 试剂盒法检测各组小鼠血清中UA、Cr 和BUN 水平及计算肾脏指数取各组小鼠血清，按照试剂盒说明书中的方法检测血清中UA、Cr 和BUN 水平。取小鼠两侧肾组织，称质量，计算各组小鼠肾脏指数：肾脏指数=小鼠肾脏质量（g）/小鼠体质量（g）×100%。

1.12 TUNEL 法观察小鼠肾组织中细胞凋亡情况将4%多聚甲醛固定的小鼠肾组织进行脱水、浸蜡和包埋，切片（厚度5 μm），参照凋亡试剂盒说明书进行TUNEL 染色处理，观察各组小鼠肾组织中细胞凋亡情况。

1.13 Western blotting 法检测各组小鼠肾组织中AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、Bcl-2、Bax 和MMP-9蛋白表达水平各组小鼠肾组织匀浆后取上清，采用BCA 法测定总蛋白浓度。取20～30 μg 组织蛋白样本经凝胶、电泳、转膜和封闭，加一抗AKT（1∶500）、p-AKT（1∶1 000）、PI3K （1∶1 000）、p-PI3K（1∶500）、Bcl-2（1∶2 000）、Bax（1∶1 000）和MMP-9（1∶1 000），洗膜，加二抗，均以1∶5 000稀释，洗膜，ECL 显色。GAPDH 一抗以1∶8 000稀释，二抗以1∶10 000 稀释。采用ImageQuant LAS 4000 凝胶成像仪分析蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平和p-AKT/AKT 及p-PI3K/PI3K比值。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH 蛋白条带灰度值，p-AKT/AKT 比值=p-AKT 蛋白表达水平/AKT 蛋白表达水平，p-PI3K/PI3K 比值=p-PI3K 蛋白表达水平/PI3K 蛋白表达水平。

1.14 统计学分析采用SPSS 23.0 统计软件进行统计学分析。各组细胞增殖活性，各组细胞中UA水平，各组小鼠血清中UA、Cr 和BUN 水平及肾脏指数， 各组小鼠肾组织中AKT、 p-AKT、PI3K、p-PI3K、Bcl-2、Bax 和MMP-9 蛋白表达水平均符合正态分布，以表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 筒鞘蛇菰活性成分和靶点筛选通过数据库和文献数据检索， 得到筒鞘蛇菰相关成分85 个，利用SwissADME 数据库筛选，得到26 个活性成分，其 中 calycosin-7-O- β -D-glucoside、β-sitosterol、（E）-1-Caffeoyl-β-D-glucopyranoside 和（E）-1-O-p-coumaroyl-β-D-glucopyranoside 不符合筛选标准，但文献数据结果显示其具有较好的生物活性，因此将其纳入分析，最终获得30 个筒鞘蛇菰活性成分。见表1。通过SwissTargetPrediction 和TargetNet 数据库对活性成分靶点进行检索筛选，利用Uniprot 数据库对靶点名称进行规范并剔除非人源的潜在靶点，删除重复靶点后，共得到323 个靶点。

表1 筒鞘蛇菰治疗HUA 的活性成分Tab. 1 Active components of Balanophora involucrata Hook.f in treatment of hyperuricemia

2.2 HUA 疾病靶点和交集靶点获取以“hyperuricemia” 和“gout” 为关键词， 采用DisGeNET、 TTD、 GeneCards、 Drugbank 和OMIM 数据库进行检索，将收集的靶点输入Uniprot 数据库进行靶点名称规范，删除重复值，整理得到疾病靶点2 247 个，与323 个活性成分靶点取交集后，共获得116 个交集靶点，即为筒鞘蛇菰治疗HUA 的潜在作用靶点。见图1。

图1 疾病靶点与活性成分靶点交集的Venn 图Fig. 1 Venn diagram of intersection of disease targets and active ingredient targets

2.3 活性成分-预测靶点网络构建构建筒鞘蛇菰活性成分-预测靶点网络（图2），其中黄色V 形代表筒鞘蛇菰，红色菱形代表筒鞘蛇菰活性成分，浅绿色圆形代表筒鞘蛇菰治疗HUA 靶点。采用Cytoscape 3.7.2 软件中Network Analyzer 工具进行网络拓扑分析，度值排名前6 位的化合物分别为没食子酸、5-羟麦芽酚、（+）-松脂素、5，7-二羟基色原酮、青霉酸和EDT，推测该6 种活性成分可能是筒鞘蛇菰治疗HUA 的主要活性成分。

图2 活性成分-预测靶点网络图Fig. 2 Network diagram of active components-predictive targets

2.4 PPI 网络构建将116 个交集靶点导入STRING 11.5 数据库并利用Cystoscope 3.7.2 软件构建PPI 网络图，共有107 个靶蛋白节点，434 条边。见图3。经拓扑分析，大于平均连接度值2 倍的靶点有14 个，丝裂原活化蛋白激酶1（mitogenactivated protein kinase 1，MAPK1）、磷脂酰肌4，5-二磷酸3-激酶催化亚基α（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA）、热休克蛋白90 α 家族A 类成员1（heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90AA1）、 磷酸肌醇3- 激酶调节亚基1（phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1）、SRC 原癌基因、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）、雄激素受体（androgen receptor，AR）、GAPDH、转录因子p65（transcription factor p65，RELA）、MMP-9、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase， mTOR） 和白细胞介 素 2（interleukin-2，IL-2），表明上述靶点可能是筒鞘蛇菰治疗HUA 的核心靶点。

2.5 分子对接结果将筒鞘蛇菰中6 种主要活性成分与14 个核心靶点进行分子对接，结合能绝对值越大表示活性成分与靶点活性中心的结合活性越强。在对接结果中，大多数络合物具有较高的结合能（表2），表明筒鞘蛇菰主要活性成分与核心靶点之间的结合活性较强，网络药理学方法预测结果较为准确。EDT 与MMP-9 结合能为-10.8 kcal·mol-1，与GLN-227、ALA-189 和MET-247 残基的结合活性最强（图4），因此选择EDT 进行下一步实验验证。

图4 EDT 与MMP-9 对接模式图Fig. 4 Docking pattern diagram of EDT and MMP-9

表2 分子对接结果Tab. 2 Molecular docking results

2.6 GO 功能和KEGG 信号通路富集分析利用R Studio 软件进行GO 功能富集分析，选择排名前15 位的通路进行可视化（图5）。其中，生物过程（biological process，BP）共富集到1 677 条，主要涉及细菌起源分子反应和AKT 信号传导等；分子功能（molecular function，MF） 共富集到119 条，主要涉及核受体活性和配体激活的转录因子活性等；细胞组分（cellular component，CC） 共富集到32 条，主要涉及膜筏和膜微区等。KEGG 信号通路富集分析共得到145 条信号通路，其中排名前30 位的信号通路涉及缺氧诱导因子1 （hypoxia inducible factor-1，HIF-1）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor， VEGF） 和PI3K/AKT 等多个通路。见图6。

图5 潜在作用靶点GO 功能富集分析Fig. 5 GO functional enrichment analysis on potential action targets

图6 潜在作用靶点KEGG 信号通路富集分析Fig. 6 KEGG signaling pathway enrichment analysis on potential action targets

2.7 各组细胞增殖活性NRK-52E 细胞经不同浓度EDT 处理后， 与空白对照组比较， 0.1～50.0 μmol·L-1EDT 组细胞增殖活性差异无统计学意义（P＞0.05），100.0 μmol·L-1EDT 组细胞增殖活性明显降低（P＜0.01），因此设置2.0、10.0和50.0 μmol L-13 个EDT 浓度进行后续实验。见表3。

表3 各组细胞增殖活性Tab. 3 Proliferation activities of cells in various groups(n=6，）

表3 各组细胞增殖活性Tab. 3 Proliferation activities of cells in various groups(n=6，）

*P＜0.01 vs blank control group.

?

2.8 各组细胞中UA 水平UA 标准曲线回归方程为y=30.520 0x+0.000 1 （R2=0.999 2），表明UA 在0.001 562 5～0.100 000 0 g·L-1范围内线性关系良好。与空白对照组比较，模型组细胞中UA水平明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，2.0、10.0 和50.00 μmol·L-1EDT 组细胞中UA 水平明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）。见表4。

表4 各组细胞中UA 水平Tab. 4 Levels of UA in cells in various groups[n=6,,ρB/(g·L-1)]

表4 各组细胞中UA 水平Tab. 4 Levels of UA in cells in various groups[n=6,,ρB/(g·L-1)]

*P＜0.01 vs blank control group； △P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group.

?

2.9 各组小鼠血清中UA、Cr 和BUN 水平及肾脏指数与空白对照组比较，模型组小鼠血清中UA、Cr 和BUN 水平及肾脏指数明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，EDT 组小鼠血清中UA、Cr 和BUN 水平及肾脏指数明显降低（P＜0.05 或P＜0.01）。见表5。

表5 各组小鼠血清中UA、Cr 和BUN 水平及肾脏指数Tab. 5 Levels of serum UA, Cr, BUN and kidney indexes of mice in various groups(n=8，）

表5 各组小鼠血清中UA、Cr 和BUN 水平及肾脏指数Tab. 5 Levels of serum UA, Cr, BUN and kidney indexes of mice in various groups(n=8，）

*P＜0.01 vs blank control group； △P＜0.05， △△P＜0.01 vs model group.

?

2.10 各组小鼠肾组织中细胞凋亡情况与空白对照组比较，模型组小鼠肾组织中可见大量凋亡细胞；与模型组比较，EDT 组小鼠肾组织中凋亡细胞数明显减少。见图7。

图7 各组小鼠肾组织TUNEL 免疫荧光染色结果（×400）Fig. 7 TUNEL immunofluorescence staining results of kidney tissue of mice in various groups (×400)

2.11 各组小鼠肾组织中p-AKT/AKT 及p-PI3K/PI3K 比值和Bcl-2、Bax 及MMP-9 蛋白表达水平与空白对照组比较，模型组小鼠肾组织中p-AKT/AKT 及p-PI3K/PI3K 比值和Bcl-2 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05 或P＜0.01），Bax 和MMP-9 蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）；与模型组比较，EDT 组小鼠肾组织中p-AKT/AKT 及p-PI3K/PI3K 比值和Bcl-2 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05 或P＜0.01），Bax 和MMP-9 蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）。见图8。

图8 各组小鼠肾组织中AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K、Bcl-2、Bax 和MMP-9 蛋白表达电泳图（A）和直条图（B）Fig. 8 Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of AKT, p-AKT, PI3K, p-PI3K, Bcl-2, Bax, and MMP-9 proteins in kidney tissue of mice in various groups

3 讨 论

目前HUA 是一个全球性的公共卫生问题，是痛风、高血压、慢性肾病和肥胖等多种疾病的独立危险因素，已成为继高血压、高血糖和高血脂之后的“第四高”［20］。2021 年数据［21］显示：我国HUA患病率为16.4%，并且呈现年轻化趋势。降低血清UA 是防治HUA 的首要策略。研究［18］显示：蛇菰可降低HUA 患者的UA 水平。但由于蛇菰成分较多，其降UA 的活性物质及作用机制尚不明确。

本研究利用网络药理学方法，通过构建活性成分-预测靶点网络和PPI 网络，多方面和多层次深入研究筒鞘蛇菰治疗HUA 的主要活性成分和潜在靶点及其作用机制，进一步通过分子对接、高尿酸细胞模型和HUA 小鼠模型实验进行验证，通过构建活性成分-预测靶点网络筛选出没食子酸、5-羟麦芽酚、（+）-松脂素、5，7-二羟基色原酮、青霉酸和EDT 等6 种活性成分，可能是筒鞘蛇菰治疗HUA 的主要活性成分；通过PPI 网络获取核心靶点14个，分别为MAPK1、PIK3CA、HSP90AA1、PIK3R1、 SRC、 EGFR、 TNF、 APP、 AR、GAPDH、RELA、MMP-9、MTOR 和IL-2；分子对接结果显示：主要活性成分与关键靶点具有较好的结合作用，其中主要活性成分EDT 与MMP-9 的对接结果最优。本研究结果提示：EDT 可能为筒鞘蛇菰的主要活性成分。基于以上原因，本研究选择分子对接中与靶点结合活性最强的EDT 用于后续的体内外实验验证，并对其作用机制进行研究。UA 是嘌呤代谢的终产物，腺苷被腺苷脱氨酶转化为肌苷，肌苷经嘌呤核苷酸磷酸化酶转化成次黄嘌呤，次黄嘌呤被XO 转化为黄嘌呤，进一步被XO 转化为UA［22-23］。本研究首先通过腺苷诱导NRK-52E 细胞建立高尿酸细胞模型，采用HPLC法检测细胞培养上清液中UA 水平，结果显示：EDT 可明显降低细胞中UA 水平；同时，采用氧嗪酸钾联合次黄嘌呤建立HUA 小鼠模型，通过抑制小鼠体内尿酸酶来减少UA 分解，补充外源性UA 前体物质，从而增加其UA 生成，模拟HUA 的效果［19，24］。本研究结果显示：模型组小鼠血清中UA 水平明显升高，表明HUA 小鼠造模成功；EDT 组小鼠血清中UA 水平明显降低，表明EDT有降UA 的作用。血清Cr 和BUN 水平是评价肾功能的重要指标。本研究结果显示：EDT 可降低HUA 小鼠血清中Cr 和BUN 水平及肾脏指数，提示EDT 可改善小鼠肾损伤。为阐明筒鞘蛇菰如何通过核心靶点产生作用，本研究进一步进行了靶点功能富集分析，KEGG 信号通路富集分析结果显示： 筒鞘蛇菰的作用可能与HIF-1、 VEGF、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药、急性髓系白血病、松弛素和糖尿病并发症中的晚期糖基化终末产物（advanced glycoslyation end product，AGE） -AGE受体（receptor of AGE，RAGE）及PI3K/AKT 等信号通路有关。P13K/AKT 信号通路是保护肾脏细胞和抑制细胞凋亡的重要信号通路［24-25］，富集靶点较多，提示其可能是筒鞘蛇菰治疗HUA 较为主要的通路。P13K/AKT 信号通路参与细胞增殖、分化和凋亡等过程［26-27］，与多种肾脏疾病的发生发展均有密切关联［28-31］。PI3K 被激活后可促进AKT的活化，活化后的AKT 磷酸化激活或者抑制其下游靶蛋白，可通过PI3K/AKT 信号通路直接调节凋亡相关蛋白Bax 和Bcl-2 的表达进而抑制细胞凋亡［32-34］。本研究结果表明：EDT 可抑制HUA 小鼠肾组织中细胞凋亡，激活P13K/AKT 信号通路，提高P13K 和AKT 的磷酸化水平，上调Bcl-2 并下调Bax 表达，以达到对肾组织的抗凋亡保护作用，缓解肾组织损伤。

MMP-9 是 基 质 金 属 蛋 白 酶 （matrix metalloproteinases，MMPs） 家族成员之一，可通过降解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）参与尿酸性肾病肾间质纤维化和肾小管损伤的过程，当尿酸性肾病导致的肾损害加重时，MMP-9蛋白表达水平升高，可促进ECM 的降解［35-36］。本研究结果显示：EDT 可下调HUA 小鼠肾组织中MMP-9 蛋白表达水平，表明其可能通过抑制MMP-9 的表达改善小鼠肾损伤。

综上所述，本研究采用网络药理学方法和分子对接技术对筒鞘蛇菰治疗HUA 的机制进行预测，阐述多种成分、多个靶点和多种通路间复杂的相互作用关系，通过分子对接技术初步验证其作用靶点，同时通过高尿酸细胞实验和HUA 小鼠实验验证了筒鞘蛇菰活性成分EDT 的降UA 活性，EDT可能通过激活P13K/AKT 信号通路抑制细胞凋亡，缓解肾损伤。本研究结果为进一步研究筒鞘蛇菰的降UA 活性成分和作用机制提供了理论依据。

利益冲突声明：

所有作者声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：

刘丽参与实验设计和实施、数据采集和分析、统计学分析及论文撰写，黄林生参与实验技术操作，赵永恒参与实验技术指导和数据分析，曹文洁和钱永帅参与实验设计和数据分析，余惠凡参与实验技术指导，李飞参与实验技术指导、实验设计、数据分析和对文章的知识性内容进行审阅并提供研究经费。