干酪乳杆菌发酵人参茎叶提取物对锦鲫免疫及抗氧化功能的影响

孟 欣， 于 鹏， 单晓枫， 钱爱东

(吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118)

锦鲫(Carassius auratus)又名草金鱼，由于其花色似锦而得名，是一种重要的观赏鱼类。饲用促生长抗生素在过去的数十年间对保障动物健康发挥了重要作用，但大量使用抗生素会影响鱼的生长及代谢，造成肠道菌群的失调，影响观赏鱼的体色和健康，导致水体耐药细菌产生[1-2]。因此，替抗产品的研究已引起广泛关注。

人参(Panax ginseng)为五加科(Araliaceae)人参属植物，是中国传统的名贵中草药，通常为人们所熟知的是人参的根[3]。人参皂苷作为人参中重要的活性成分，在人参中含量较多且种类丰富，药理活性表明其普遍具有抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、调节肠道微生物功能等作用[4]。我国作为人参栽培大国，此前人参茎叶一般是作为废料丢弃，但为了使人参的应用更为多元化，人参资源尽可能地有效利用，学者们开始对人参地上部分的化学成分以及相关药理作用进行研究[5]。稀有皂苷相较于原型人参皂苷而言其生物活性更加多元化，且更易被机体所吸收，但其提取方式相对繁难[6]。在人参的加工品中，其功效最主要通过稀有皂苷的含量来评价，因此，现在已经有大量关于稀有人参皂苷转化的研究，且发现人参茎叶所含皂苷含量是人参各部位中最多的，皂苷结构更具多样性，可作为人参皂苷提取的重要资源。因此，对于人参茎叶资源的利用不仅可以更好的发挥人参的地上价值，同时可以减少资源浪费，保护环境。

微生物发酵是中药材的重要炮制手段之一，在发酵过程中利用微生物将中草药的有效成分更高效地分解出来，增强或新添功效，扩大治疗范围[7]。与此同时，通过发酵产生新的活性物质，节约中药材资源的同时增加中药制剂的多元性及安全性[8]。由于大多数水产动物无法分解组成中药材细胞壁的纤维素和半纤维素，导致中药材的有效成分很难被鱼体吸收从而产生浪费[9]。通过益生菌发酵中药技术可以有效地破坏中药材的细胞壁，使活性成分溶解，减少药物的用量。另外，发酵所使用的益生菌还可以调节胃肠道菌群，改善胃肠道功能，控制肠道内腐败菌生长[10]。因此，益生菌发酵中药在鱼类养殖中的应用逐渐受到重视。

研究表明，利用益生菌发酵中药的抑菌效果要比单独使用中药水提液或仅用益生菌的效果显著。同时有研究表明，微生物可以通过去糖基化作用使人参固有皂苷向稀有皂苷转化，增强人参的药理活性[11]。随着人们对人参地上部分研究的不断深入，学者们发现发酵后的人参茎叶中皂苷类成分之间会发生转化，Rg3、Rh2、Rh1等稀有皂苷的水平有所升高[12]。其中人参皂苷Rg3作为稀有皂苷已被证实可以抑制肿瘤生长，改善心脏功能[13]。目前对于益生菌发酵人参茎叶以及其有关活性成分作为饲料添加剂多应用于畜牧业，在水产领域还尚未见报道，对于发酵人参茎叶应用于水生动物时所使用的适配菌方面的研究还有待探究。因此，本实验利用不同干酪乳杆菌(Lacticaseibacillus casei)菌液接种量作为发酵菌种对人参茎叶进行液体发酵，将发酵产物与饲料均匀混合后进行动物体内实验，评估其对于锦鲫免疫及抗氧化功能的影响，同时筛选出在本实验条件下干酪乳杆菌在发酵人参茎叶提取物时的最佳接种量，以期为益生菌发酵人参茎叶在水生动物养殖中的应用中提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验选用干酪乳杆菌ATCC393、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophilaTPS-30)均由吉林农业大学预防兽医学实验室保存。人参茎叶提取物，即人参茎叶总皂苷，由吉林农业大学中药学院提供，测得总皂苷含量≥80%, 采用水提取大孔吸附树脂富集方式制备。

1.2 细菌培养及实验饲料的制备

干酪乳杆菌的活化及培养将干酪乳杆菌ATCC393于MRS固体培养基划线，37 °C厌氧条件下过夜培养，接种单菌落于MRS液体培养基中，37 °C条件下厌氧培养24 h。将菌悬液5000 r/min离心15 min，弃上清液，并加入等量无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS)，反复离心3次，用平板计数的方法确定干酪乳杆菌的菌液浓度，调整菌液浓度至1×108CFU/mL，置于4 °C冰箱保存备用。

中药液制备称取4份中药人参茎叶提取物(8 g/份)，分别将其置于4个已灭菌50 mL的锥形瓶中，每瓶加入20 mL蒸馏水，保证中药提取物均溶于水中后，于121 °C下高压灭菌20 min，置于4 °C冰箱保存备用。

中药发酵液的制备在4个已灭菌的250 mL锥形瓶中，分别加入200 mL pH 6.0的MRS液体培养基，随后按3%、4%、5%、6%(干酪乳杆菌菌液体积/培养体系总体积)的比例接种干酪乳杆菌菌液，37 °C厌氧条件下发酵24 h后，即得到中药发酵液，测得发酵液pH为3.5。

饲料的制备将4份中药发酵液分别与1 kg基础饲料混合均匀，置于37 °C恒温箱烘干后，即得到4种实验饲料，干酪乳杆菌菌液接种量为3%、4%、5%和6%的饲料分别记为L3、L4、L5和L6，对照组饲喂基础饲料记为L0，置于4 °C下低温避光保存。基础饲料配方中鱼粉35%、菜籽粕20%、大豆18%、小麦粉18%、酵母粉6%、氯化钠1%、维生素1%、矿物质1%。营养成分分别为粗蛋白质33%、粗纤维8%、粗灰分12%、粗脂肪3%、水分9%、总磷1%、总赖氨酸1.5%。

1.3 实验日常管理

实验用锦鲫购买于长春某鱼市，初始平均体重为(25.00±0.05) g，在吉林农业大学水产养殖基地控温单循环养殖系统中进行饲养。实验前1周使用高锰酸钾对鱼缸内进行全面消毒，并提前3 d向其内注水。实验锦鲫入水前，在3%浓度的盐水中浸洗消毒10～15 min。在实验前2周使用基础饲料饲喂，并观察健康情况。暂养期结束后，挑选出健康无病的锦鲫250尾，并随机平均分配到5个圆柱形玻璃鱼缸内(r=40 cm，h=110 cm，每缸容水量约为550 L)。分别用上述5组饲料持续投喂5周，日投饵率为锦鲫平均体重的3%～4%，每日分别在8:00和17:00投喂2次。实验在循环水系统中保持24 h持续供氧，每天更换1/3的水，保持养殖期间的水质指标，水温设定为27～29 °C，溶解氧含量大于5 mg/L，氨氮值小于0.02 mg/L。本研究获得了吉林农业大学实验动物管理和使用伦理委员会批准，实验过程中操作人员严格遵守吉林农业大学伦理规范，并按照吉林农业大学伦理委员会制定的规章制度执行。

1.4 样品收集与指标检测

样品收集分别在养殖第0、7、14、21、28和35天进行取样，每次取样前空腹24 h，每组随机抽取3尾鱼，尾部静脉抽血，将血液置于37 °C温箱0.5 h后，4 °C冰箱过夜，4 °C、5500 r/min离心15 min后，提取血清，分装置于−80 °C冰箱中保存。无菌条件下采集脏器(肝胰脏、脾脏、中肾、全肠)，液氮速冻后，置−80 °C冰箱保存，用于后续相关免疫指标的测定。

血清学指标检测溶菌酶(LZM)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、免疫球蛋白M(IgM)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)以及丙二醛(MDA)均使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行检测，具体检测方法依照试剂盒说明书进行操作。

细胞因子表达量的测定通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法检测锦鲫各脏器组织中IL-10、TNF-α、TGF-β、IFN-γ和IL-1β的相关表达量。所需研钵均在烘干箱170 °C干热4 h后使用，操作台为提RNA专用操作台，枪头、离心管均为无RNA-free。按BioFlux总RNA提取试剂盒说明书，提取各脏器组织总RNA，将总RNA反转录为cDNA，置于−80 °C保存。以各组织的cDNA作为模板，进行qRT-PCR操作，反应体系20 μL∶2×Taqmix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA 模板2 μL，无菌水补充至20 μL。反应条件∶95 °C预变性30 s；95 °C变性5 s，55～61 °C退火30 s (不同引物退火温度不同)，40个循环。对照组样品作为参照，每个样品设定3个重复，内参基因选择β-actin(表1)。

表1 qRT-PCR 引物序列Tab. 1 Primer sequence of qRT-PCR

1.5 攻毒保护性实验

饲喂实验结束后，选择嗜水气单胞菌TPS进行攻毒实验。每组选择20尾规格相近的鱼，每尾腹腔注射1×108CFU/mL的嗜水气单胞菌0.1 mL后恢复投饵，并记录攻毒后14 d内各组锦鲫的发病症状以及死亡情况，初步检测不同干酪乳杆菌菌液接种量的发酵产物对锦鲫嗜水气单胞菌攻毒的保护效果。

1.6 数据分析

除攻毒保护性实验外，其余结果均采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，若方差分析显著，进一步利用Duncan氏进行多重比较，显著水平设定为0.05。

2 结果

饲喂实验结束时，各组体重均有增加，平均体重为(30.16±0.07)g。4个饲喂发酵液组别存活率均为100%，体表健康，活力正常，摄食情况均较好，每天2次投食可在5～10 min吃完。

2.1 不同发酵液对锦鲫血清生化指标的影响

与L0组相比，L4、L5和L6组AKP活性均在整个实验期间有明显的上升趋势，并显著高于L0组(P＜0.05)；其中L5组在第35天时达到AKP活性的最高值(图1)。L5组LZM活性在第28天时LZM活性达到最高，显著高于L0组(P＜0.05)，其他组别的上升趋势并不显著(P＞0.05)。各发酵液组间相比较，L5组SOD活性上升最为明显，从第21天开始呈现持续上升趋势，并在第35天时达到最高，显著高于L0组(P＜0.05)，其余3个发酵液组别的SOD活性在整个实验期间上升趋势并不显著(P＞0.05)。四个发酵液处理组的CAT活性均表现上升趋势，其中L5组上升趋势最为显著，在第28天时活性显著升高并达到最高值(P＜0.05)。4组发酵液处理组别GSH-Px活性在整个实验期间均表现出不同程度的上升，其中L5组上升最为明显，并在第28天时达到最高值，与L0组相比有显著差异(P＜0.05)。与L0组相比，4个发酵液处理组MDA含量均呈下降趋势，但各组下降趋势并不显著(P＞0.05)，其中L5组在第35天时达到最低。各发酵液处理组的IgM活性均有上升趋势，但并不明显(P＞0.05)，但L5组在第28天时IgM活性最高。

图1 不同发酵液对锦鲫血清生化指标的影响L0. 对照组，L3. 干酪乳杆菌接种量3%的发酵液，L4. 干酪乳杆菌接种量4%的发酵液，L5. 干酪乳杆菌接种量5%的发酵液，L6. 干酪乳杆菌接种量6%的发酵液；下同。Fig. 1 Effects of different fermentation products on serum biochemical parameters of C. auratusL0. control group, L3. fermentation broth group with 3% inoculation amount of L. casei, L4. fermentation broth group with 4% inoculation amount of L.casei, L5. fermentation broth group with 5% inoculation amount of L. casei, L6. fermentation broth group with 6% inoculation amount of L. casei; the same below.

2.2 不同发酵液对锦鲫免疫相关基因表达的影响

发酵产物对锦鲫各脏器组织中不同免疫相关基因的表达量影响显著(图2)。在肝胰脏组织中，与L0组相比，IL-10和TNF-α基因表达水平整体随干酪乳杆菌菌液接种量的增加呈先上升后下降的趋势，L5组均在第35天达到最高值，表达量与L0组均有显著的差异(P＜0.05)。IFN-γ基因表达量在L6组第28天时最高，与L0组有显著的差异(P＜0.05)。四个经发酵液处理的组别中，TGFβ基因表达水平均随时间的增加呈先上升后下降的趋势，其中L5组在第14天时表达量达到最高值，与L0组有显著差异(P＜0.05)。IL-1β基因的表达量在第21天时L5组表达量最高，显著高于L0组(P＜0.05)。

在脾脏组织中，IL-10基因从第21天开始，L4组、L5组、L6组有了显著的上升趋势(P＜0.05)，其中在第28天时L5组的基因表达量最高(图3)。TNF-α、IFN-γ的基因表达量均随饲喂时间的增加呈现持续上升的趋势，并在第35天时达到最高值，其中L5组的TNF-α和IFN-γ基因表达水平均最高，与L0组有显著的差异(P＜0.05)。IFN-γ的基因表达水平随着干酪乳杆菌菌液接种量的增加呈先上升后下降的趋势，在浓度达到5%时表达量达到最高值，同时在第35天时L4组、L5组、L6组均显著高于L0组(P＜0.05)，其中L5组表达量最高。4个发酵液处理组TGF-β的基因表达水平整体随饲喂时间的增加呈先上升后下降的趋势，均在第21天时达到最高，其中L5组的表达量最高并于L0组有显著差异(P＜0.05)。与L0组相比，各组IL-1β基因表达水平随饲喂时间的增加呈先上升后下降的趋势，其中L5组表达量与L0组有显著差异(P＜0.05)。

在中肾组织中，IL-10基因的表达量上升趋势最为敏感，在第35天时4个发酵产物处理组均有显著的提高(P＜0.05)，同时L5组IL-10基因的表达量最高(图4)。TNF-α的基因表达水平均随时间增加呈现持续上升的趋势，在第35天时L4组、L5组、L6组均有明显的升高，均显著的高于L0组(P＜0.05)，其中L6组TNF-α的水平最高。IFNγ基因的表达水平在整个饲喂时间中呈先升高后下降的趋势，并从第21天开始L5组、L6组的表达量均有明显上升，与L0组有显著差异(P＜0.05)。TGF-β基因表达量在第21天时达到最高，其中L5组、L6组均和L0组有显著差异(P＜0.05)。IL-1β基因在第21天时L6组与有显著的上升(P＜0.05)，L5组在第28天时显著的高于L0组(P＜0.05)，其他组别并无显著升高趋势(P＞0.05)。

图4 不同发酵液对锦鲫中肾免疫炎症因子的mRNA表达水平的影响Fig. 4 Effects of different fermentation products on the mRNA expression levels of immune inflammatory factors in mesonephridium of C. auratus

在全肠组织中，与对照组相比，发酵产物处理组IL-10、TNF-α和IFN-γ的水平随着干酪乳杆菌菌液接种量的升高而呈现先上升后下降的趋势，L5组表达量最高，显著高于L0组(P＜0.05)；并且均在第21天有了显著的升高，L5组均在第35天时达到最高值，但其中IL-10的水平升高最为敏感。TGF-β基因的表达水平在在整个饲喂时间内呈先上升后下降的趋势，L5组第21天时达到最高水平，与对照组有显著的差异(P＜0.05)。IL-1β基因的表达水平随着干酪乳杆菌菌液接种量的增加呈现先上升后下降的趋势，L5组表达量最高，从第21天开始便显著的高于L0组(P＜0.05(图5)。

图5 不同发酵液对锦鲫全肠免疫炎症因子的mRNA表达水平的影响Fig. 5 Effects of different fermentation products on the mRNA expression levels of immune inflammatory factors in intestine of C. auratus

2.3 攻毒实验结果

攻毒实验结果显示，L0组在9 d内全部死亡，并且腹部出现肿胀，体表出血，解剖后发现腹腔内多脏器出现出血或化为血水等现象(图6)。L3组在13 d内全部死亡，L5组的存活率相较于其他组而言最高，达到30%，L6和L4组存活率分别为20%和10%。

图6 不同发酵液对锦鲫攻毒后存活率的影响Fig. 6 Effects of different fermentation products on survival rate of C. auratus after challenge

3 讨论

3.1 不同发酵液对于锦鲫血清生化指标的影响

体液免疫指标对于鱼生理和健康情况起着非常重要指示作用，反映了机体营养和环境的变化。AKP、IgM和LZM均在机体的非特异免疫防御中发挥着重要的作用，在机体受到病毒侵害时可迅速分泌从而起到抵御病原的作用[14]。AKP是一种胞外金属酶类，可加快吞噬细胞的吞噬，提高水生动物机体免疫力[15]。IgM作为体液免疫重要组成部分，是介导体液免疫的重要效应分子，可与相应抗原特异性结合，发挥体液免疫功能。LZM是单核巨噬细胞的分泌酶，可水解细胞壁中黏肽的乙酰氨基多糖并使之裂解，破坏侵入机体的有害细菌，从而帮助机体达到防御的目的[16]。有研究表明，乳酸菌作为饲料添加剂可以增加黏膜特异性免疫反应，从而提高机体血清中 LZM及IgM活性[17-18]。Mohammadian等[19]研究中还发现饲料中添加干酪乳杆菌可以使鲤(Cyprinus carpio)血清AKP和LZM活性升高。有学者发现，利用益生菌对于中药进行发酵同样可以提高鲤鱼抗感染能力以及非特异性免疫能力[20]。本实验选择干酪乳杆菌对人参茎叶提取物进行发酵，其发酵产物可以提高锦鲫血清中AKP、IgM、LZM活性，在干酪乳杆菌接种量为5%时活性达到最高值。进一步说明该发酵产物能够激活鲫非特异性免疫应答，分泌免疫相关酶类。

氧化应激是水产动物发生疾病的主要原因之一， SOD、CAT和GSH-Px作为机体抗氧化酶，其活性的高低可以直接反映出机体的抗氧化水平[21]。SOD主要作用是将超氧阴离子转变为H2O2，从而降低氧化毒性，以阻止氧自由基对细胞造成伤害[22]。GSH-Px作为可以在机体分解的酶，可以催化GSH和H2O2的反应，将H2O2转变为H2O，起到保护细胞膜结构和功能的完整的作用[23]。CAT则可以将H2O2转变为H2O和O2，可以清除对机体有害的超氧自由基，降低机体氧化应激反应[24]。MDA是用于反映氧化损伤的典型参数，具有细胞毒性，会加剧细胞脂膜氧化，其含量的高低间接的反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度[25]。有研究表明，鱼类肠道定植的乳酸菌具有抗氧化活性，蔡红丹等[26]在对点带石斑鱼(Epinephelus coioides)的研究中发现，饲料中添加益生菌可以显著的提高鱼血清中SOD的活性。发酵人参茎叶在畜牧业的应用相对较多，牟柏德[27]在实验中添加酵母菌混合菌种发酵人参茎叶药渣，发现蛋鸡产蛋的蛋黄中SOD和GSH-Px含量显著高于对照组，MDA含量显著低于对照组。李艳娇等[28]研究发现，饲喂添加发酵人参茎叶的饲料可提高小鼠(Mus musculus)血清中SOD的含量，降低MDA的含量，说明发酵人参茎叶可对机体的抗氧化能力有所提高。这也证实了人参茎叶在发酵后其产物中所包含的活性物质以及其药理作用更为丰富。本研究结果显示，在饲料中添加干酪乳杆菌发酵人参茎叶产物可提高锦鲫血清中SOD、CAT、GSH-Px的活性，降低MDA的含量。吕战旗等[29]研究发现，利用黄体菌发酵丹参可显著提高丹参的抗氧化活性。屈青松等[30]研究发现，利用发酵乳杆菌发酵人参，发酵产物中皂苷含量均有一定升高，可对人参皂苷进行转化，人参匀浆SOD 活性也较发酵前有所提高。在本研究也显示发酵后的人参茎叶对于锦鲫机体抗氧化能力有一定的促进作用，猜测是发酵使人参茎叶中的皂苷发生转化，稀有皂苷的含量升高，发酵产物中多物质共同作用所致。因为技术手段的限制，本研究中未能对发酵前后的人参茎叶进行稀有皂苷的定量分析。

3.2 不同发酵液对于锦鲫免疫基因表达的影响

细胞因子具有调节先天性免疫、适应性免疫以及受损组织修复等作用，可迅速响应病原体感染和激活免疫细胞以应对细菌的攻击[31]。IL-10作为机体的重要抗炎因子之一，具有促使B细胞增殖分化及抗体分泌的效应，是与免疫应答密切相关的调节因子[32]。IL-10和IFN-γ对于激活巨噬细胞活性和促进淋巴细胞增殖均具有调节作用，是天然免疫系统的重要刺激因子，常被用作免疫调节研究中的参考基因[33]。TNF-α能够提高中性粒细胞的吞噬能力，诱导正常细胞增殖与分化，在机体受到病毒和细菌的侵袭时能增加抗感染作用[34]。IL-1β在机体损伤以及病原入侵时被活化，能够独立杀菌或诱导细胞凋亡，进而达到清除病原的功能[35]。TGF-β是新近发现的调节细胞生长和分化的活性多肽类物质, 对细胞的生长、分化和多种生理、病理过程发挥重要调节作用[36]。本实验中各组织IL-10、TNF-α、TGF-β、IFN-γ、IL-1β的表达水平均有不同程度升高，其中IL-10的表达水平升高更敏感。不同组织对于基因表达量响应的先后时间也有一定的不同，在本实验条件下，全肠组织对于各基因的响应均较快速，除了IFNγ基因外，全肠组织中其他各基因的表达水平均在第14天时表现出显著的上升(P＜0.05)。肝胰脏组织中对于IL-10水平的表达与其他组织相比更为快速，从第7天开始干酪乳杆菌菌液接种量较高的组别便表现出显著的升高(P＜0.05)。上述结果表明，人参茎叶发酵液对机体的免疫调节可能存在时空差异。中药有效成分通常是经肠道菌群转化之后发挥肠道消炎的作用，但考虑到鱼类个体肠道菌群的差异性以及肠道微生物的复杂性，通过益生菌体外发酵后服用效果会更好[37-38]。人参也具有调节肠道微生物的作用，与益生菌发酵可以促进益生菌的生长，抑制有害菌的生长[39]。Jang等[40]给予患有结肠炎的小鼠口服乳酸菌发酵红参，发现其TNF-α以及相关炎症基因的表达有升高，提高其药效的同时可以防治肠道炎症类疾病。鱼类与畜禽类动物相比，消化道短，消化能力弱，肠道壁结构薄且简单，更容易受到损伤，所以对于鱼类肠道的健康应该受到重视[41]。孔雨昕等[42]利用3种乳酸菌饲喂乌鳢 (Channa argus)发现其各组织中IL-1β、IL-10和TNF-α基因表达水平均有不同程度升高，在肠道组织中均有促进作用。Kong等[43]研究发现，重组干酪乳杆菌经鲫口服后，鲫肝脏、脾脏、肾脏和肠中IL-10、IL-1β、IFN-γ和TNF-α水平在组织中显著上调，提示重组干酪乳杆菌具有诱导细胞因子表达、增强先天免疫应答的能力，与本研究结果相似。王雨珊等[12]研究发现，发酵乳杆菌发酵人参后可以提高其中Rg3和Rh2等稀有人参皂苷的含量，其中Rg3可显著改善肝癌细胞SMMC-7721凋亡形态，Rh2可抑制肝脏纤维化，口服给药可以缓解小鼠酒精性肝损伤，抑制肝胰脏炎症反应。说明发酵后的人参可以对肝胰脏有一定的保护作用。对于益生菌发酵中药在鱼类养殖中对于免疫相关因子的作用机制还有待进一步探究。

3.3 不同发酵液对于锦鲫攻毒后存活率的影响

研究发现，嗜水气单胞菌是引起淡水鱼类绝大多数细菌性疾病的病原菌，因此，采用嗜水气单胞菌作为攻毒实验的感染菌株，能较好地评价该发酵产物对于锦鲫抗病力的影响[44]。通过攻毒保护性实验评价发酵产物的保护性，结果显示，发酵产物处理的组别存活率高于对照组的存活率，其中L5组的存活率最高。表明干酪乳杆菌发酵产物对锦鲫具有保护作用，可以一定程度抵抗病原菌感染，当干酪乳杆菌的接种量为5%时发酵产物的保护效果最好。Harikrishnan等[44]在金鱼(C. auratus)的研究中发现，在摄食中草药后其对于嗜水气单胞菌的抵抗能力有所升高，死亡率降低，证实了中草药对于鱼体的免疫保护作用。覃初斌[45]在研究干酪乳杆菌对斑马鱼(Danio rerio)抵御气单胞菌感染的实验中发现，干酪乳杆菌可以显著提高维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)攻毒后斑马鱼的存活率，说明益生菌作为饲料添加剂可以增强鱼体的免疫，从而提高存活率。谢全喜等[46]发现，在饲料中添加鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)发酵的中草药后，能有效抵抗肉鸡对于大肠杆菌(Escherichia coli)感染。Gu等[18]发现，利用乳酸杆菌发酵复方中药的抑菌效果要比单独使用中药水提液或仅用益生菌的效果显著，并可以显著缓解大肠杆菌所引起的仔猪腹泻，这也表明通过益生菌发酵中药可以提高其抗菌抗病毒作用。本研究中，发酵液组对嗜水气单胞菌(A.hydrophila)的抗感染能力增强，推测由干酪乳杆菌、人参茎叶提取物中活性成分以及发酵所产生的新物质共同作用所致。研究表明人，参茎叶皂苷即是免疫增强剂又是免疫调节剂，能明显提高抗感染的能力[47]。田丰群等[48]发现，人参茎叶皂苷体内治疗可使感染后的创伤小鼠死亡率明显降低，表明其可以促进创伤后细胞的免疫功能，进而增强机体对伤后感染的抵抗力。这也证实了人参茎叶对于机体的免疫保护作用具有一定的贡献。

4 结论

综上所述，利用干酪乳杆菌发酵人参茎叶，其发酵产物可以提升锦鲫抗氧化以及先天免疫应答的能力，并证实了该发酵产物可有助于鱼体较好的预防并降低嗜水气单胞菌的感染。本实验条件下5%为最佳干酪乳杆菌接种量。有关益生菌发酵中药的相互作用机理还需进一步挖掘。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）