基于网络药理学及分子对接技术探究黄连解毒汤治疗脓毒症的分子机制*

马世河，惠普晟，龙 漫

1 重庆市开州区人民医院，重庆 400000； 2 重庆医科大学附属第一医院，重庆 400000；3 湖北中医药大学，湖北 武汉 430000

脓毒症是由于感染引起的全身性免疫反应失调而导致的器官功能障碍，因该病进展快、疾病诊断和治疗不当，常引发脓毒症休克，危及患者生命［1］。现代医学主要依赖控制感染源、液体治疗、抗生素治疗、糖皮质激素、免疫球蛋白、血管活性药物及血液净化等手段治疗脓毒症［2］。近年来，尽管新的治疗策略不断发展，但该病的死亡率仍处于高位，而这一形势在医疗欠发达地区更为严峻［3］。

近年来，中医在治疗脓毒症及改善患者临床症状上优势凸显。中医学中并无“脓血症”这一病名，目前主要依据脓毒症临床表现的中医特征，将其归纳至“温病”及“外感热病”范畴，以“热、毒、瘀、虚”为其核心病机［4］。黄连解毒汤首见于《肘后备急方》，唐代王焘将其收录至《外台秘要》，是清热解毒的代表方剂，在临床上治疗热毒型脓毒症每获良效。黄连解毒汤由黄连、黄柏、黄芩、栀子组成，四药合用、苦寒直折，主治三焦火毒证，证见大热烦渴、错语不眠或则热病发斑。研究表明，黄连解毒汤可抑制脓毒症引起的炎症因子释放；调整血小板活化功能，对降低脓毒症死亡率有较大作用［5］。然而黄连解毒汤复方有效成分多样，潜在分子机制尚不明确。本研究基于网络药理学“分子-靶点-通路-疾病”的理论，探究黄连解毒汤治疗脓毒症的生物学机制，为以后进一步实验提供研究方向。

1 资料与方法

1.1 数据库及软件资源中药系统药理学分析平台（TCMSP；http：//tcmspw.com/tcmsp.php）；DisGeNET Database v5.0（http：//www.disgenet.org/）；Gene Card 数据库（https：//www.genecards.org/）；OMIM数据库（https：//omim.org/）；疾病靶点标准化数据库（Uniport，https：//www.uniprot.org/）；美国国家生物信息中心数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）；Venny 软件、STRING平台、Cytoscapes 3.2.1软件。

1.2 黄连解毒汤活性成分筛选在TCMSP 数据库［6］中依次输入活性成分及药物作用靶点黄连、黄柏、黄芩、栀子，以口服生物利用度（OB）≥30%，药物相似性（DL）≥0.18，血脑屏障透过率（BBB）≥-0.3为条件［7］，筛选活性成分。另外，在中国知网、PubMed及万方3 个数据库中搜索上述4 味药物的药理研究及化学成分，寻找可能与脓毒症相关的活性成分，同时将未被列入TCMSP 数据库或因上述筛选条件被删除的作为补充。将筛选后的活性成分再次通过TCMSP 数据库，以获得活性成分相关作用靶点。

1.3 脓毒症相关靶点挖掘以“sepsis”为搜索词，在以下数据库进行检索，获得脓毒症相关靶点的信息：Gene Card 数据库（https：//www.genecards.org/）；OMIM数据库（https：//omim.org/）；DisGenet数据库（https：//www.disgenet.org/）。

1.4 药物活性成分靶点构建药物-作用靶点网络。利用上述步骤获取的黄连解毒汤中有效活性成分的相关靶点及疾病相关靶点名称，上传至Uniport数据库及美国国家生物技术信息中心数据库，设置种属为“Homo sapiens（Human）”，获得靶点转化后的基因名称。利用Venny 2.1（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）在线工具绘制黄连解毒汤活性成分靶点和黄连解毒汤靶点的韦恩图，并得到交集靶点。利用Cytoscape 3.7.1 软件其中的“Network Analyzer”功能对中药化学成分-作用靶点网络进行分析，运用上述方法识别黄连解毒汤中潜在的活性分子成分和靶点，构建活性成分-靶标-通路-疾病的网络。

1.5 蛋白质互作网络拓扑分析及筛选关键靶点将上述药物-疾病交集靶点上传至STRING 平台，限定研究物种为“人（“Homosapiens”），最低相互作用评分设置为最高置信度［“highest confidence（0.900）”］，其余参数保持默认设置，得到黄连解毒汤作用于脓毒症的药物靶蛋白-疾病靶蛋白（protein-protein interaction，PPI）相互作用网络。

1.6 GO功能分析及KEGG通路富集分析在DAVID（the database for annotation，visualization and integrated discovery）数据库中导入黄芩、黄连、黄柏、栀子的作用靶标，限定物种为“Homo Sapiens”，将靶基因名修正为官方名称（official genesymbol），设定阈值P＜0.05，进行基因本体（gene ontology，GO）生物过程分析、京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

1.7 分子对接虚拟筛选是快速发展的药物筛选技术之一，而分子对接是必不可少的活性化合物筛选的手段。采用AutoDock 软件对化合物-靶点-通路-疾病（PPI）网络中得分数最高的JUN 及TNF 蛋白质进行分子对接及三位结构模拟。化合物及蛋白质的三维结构从蛋白质数据库（PDB）网站获得。在AutoDockTools 软件中对上述蛋白受体和配体进行加氢、加电荷处理，再用其插件Autogrid 得到对接活性位点，进行分子对接，得到结合能（affinity）。此外，配体与靶标的相互作用通过配体相互作用图模块进行可视化处理。

2 结果

2.1 黄连解毒汤有效化合物成分及靶点筛选采用“1.2”项下方法，删除重复化合物后得到有效化合物206个，并通过在中国知网、PubMed等文献数据库中检索，补充因筛选条件被删除而对脓毒症有一定作用的化合物，共得到有效化合物成分6个。将此化合物在TCMSP中再次输入，得到对应靶点共211个，其主要活性成分见表1。

表1 黄连解毒汤活性成分（前20位）

2.2 构建网络“活性成分-药物”靶点网络每一活性成分映射的对应靶点通过Cystoscopes 软件绘制［8］，其中蓝色代表复方，绿色代表中药小分子，红色代表在多味中药中出现的小分子，黄色代表靶基因，节点（node）意为黄连解毒汤中所含药物活性成分及其作用靶点；边（edge）则表现了中药成分和其作用靶点之间的联系。见图1。

图1 “活性成分-药物”靶点网络

2.3 脓毒症靶点基因采集通过“Gene Cards、OMIM、DisGenet”数据库以疾病名称“Sepsis”搜索，其中“Gene Card”数据库获得靶点1590 个，OMIM 数据库筛选出301 个基因靶点，DisGenet 数据库筛选出1264 个基因靶点，将上述靶点去重后共得到1891个靶点。

2.4 化合物及脓毒症靶点标准化及筛选共同靶点的PPI 网络构建。将上述“2.1”项及“2.2”项步骤中所得的靶点依次上传至Uniport或NCBI数据库，将蛋白转换为标准基因名称。然后运用Venny 2.1 软件绘制两者交集的韦恩图，显示两者共有基因105 个，包含IL-10、CXCL8、CRP 等，见图2。在STRING平台进行数据处理后，网络中有105个靶点之间存在蛋白相互作用。见图3—4。

图2 药物-疾病靶点韦恩图

图3 PPI网络图

图4 barplot图

2.5 GO 及KEGG 分析结果105 个交集靶点得到的GO 条目以P值大小排序，主要影响的前20 个生物进程，主要包括细胞因子受体、细胞因子激活等。KEGG通路富集分析发现106个交集靶点基因显著富集在152条通路上，按照P值从小到大的顺序筛选前20 条，其中最有意义的20 条通路包括AGEs-RAGE通路、TNF信号通路、IL-17通路等，再将数据进行可视化处理。圆点越大则基因数量越多，颜色代表富集显著性，颜色越红则富集性越高。见图5—6。

图5 GO分析图

图6 KEGG信号通路图

2.6 分子对接结果所有分子与蛋白质的结合能均小于0，且波动在-5.5～-11.9 KJ/mol 之间，表示所有配体可以自发地与受体结合其中吴茱萸次碱与TNF结合最好，进一步证明了黄连解毒汤中的活性成分在治疗脓毒症中起重要作用。见表2、图7。

图7 TNF-Rutaecarpine分子对接

表2 分子对接结果

3 讨论

脓毒症常发生于重大伤害或严重感染之后，由其引发的感染会引发循环衰竭，进而导致细胞和多器官代谢功能障碍，占脓毒症预后不良原因的大多数［9］。王林等［10］研究表明，黄连解毒汤能明显改善脓毒症热毒型患者体内白细胞、降钙素原（procalcitonin，PCT）、C 反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）等炎症因子水平。黄连解毒汤复方中药制剂成分复杂，其作用途径涉及靶点较多，从多维度、多层次针对疾病各个方面。本研究基于网络药理学技术，探讨了中药复方黄连解毒汤治疗脓毒症的作用机制。

在本次研究中，黄连解毒汤治疗脓毒症主要活性成分为小檗碱、黄连碱、黄芩苷、黄芩素、槲皮素等。REN 等［11］研究表明，黄连解毒汤主要的黄芩黄酮类化合物和环烯醚萜类化合物对炎症模型大鼠具有协同抗炎作用，能明显降低大鼠血浆中IL-6、IL-1β、MIP-2、TNF-α 表达水平。晋金兰等［12］研究表明，小檗碱通过降低脓毒性心肌病模型大鼠心肌组织中Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）的上调，还降低了心肌组织中TNF-a 和IL-1β的含量。黄芩苷具广谱抗菌、抗病毒活性，对多种细菌、真菌、病毒有抑制作用，其机制可能与干扰细胞壁合成、损伤胞浆膜、影响细胞蛋白合成、影响核酸合成、干扰遗传密码复制等有关［13-14］。另有研究表明，脓毒症的发展中，活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）的产生和氧化应激起关键作用。这种氧化应激会损害细胞膜和其他细胞大分子，槲皮素是强大的抗氧化剂，抑制ROS 并激活肺细胞的酶促抗氧化系统，减轻由脓毒症引起的肺损伤［15-16］。PPI分析表明，黄连解毒汤中有效成分可能是通过c-Jun 氨基末端激酶（jun kinase，JNK）、TNF、Akt 丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT serine/threonine kinase 1，AKT1）、肿瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）、IL-6 等靶标作用于脓毒症。GO 生物过程分析提示，黄连解毒汤通过影响细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性、信号转导受体激活剂等途径，改善脓毒症所致的机体炎症及对器官组织的功能损伤。KEGG 富集分析显示，黄连解毒汤作用通路主要涉及AGEs-RAGE通路、HIF-1通路、IL-17信号通路及TNF 信号通路等。晚期糖基化受体（RAGE）与晚期糖基化产物（AGEs）结合后在人体影响各组生物进程。CHEN 等［17］证实，晚期糖基化受体通过影响T 细胞的表达在炎症反应的始动和持续作用中扮演重要角色，并且RAGE 参与T 细胞向Th1 表型的分化的过程。此外，研究证明，抑制RAGE 的活性对于腹腔感染、脓毒症具有正面作用［18］。低氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）在机体对病理应激和环境适应的反应中发挥重要作用。当抑制糖酵解代谢时，LPS 处理巨噬细胞的炎症反应减轻，IL-1β的产生减少，这表明抑制HIF-1α 介导的有氧糖酵解是逆转脓毒症过程的潜在靶点。可调控下游相关细胞因子发挥抗炎、抗氧化、抗凋亡作用，从而改善因脓毒症导致的心肌等器官对的损伤［19-20］。IL-17a 作为宿主免疫的重要组成部分，对细菌、真菌、病毒和寄生虫引起的感染具有强大的保护作用。一系列研究表明，脓毒症患者IL-17a循环水平升高，调控IL-17a 的表达可降低全身促炎细胞因子或趋化因子水平，提高脓毒症患者生存率［21］。TNF-α是关键的促炎因子，其通过细胞因子级联反应，引发炎症连锁反应，产生“炎症风暴”，从而引起心、肺、肾等组织器官损伤及功能障碍等［22］。在脓毒症患者中，TNF-α 的浓度升高水平与脓毒症的严重程度呈现正相关［23］。此外，刘雨浓等［24］证实，黄连解毒汤有效组分通过抑制Caspase-11 介导的细胞焦亡信号通路，进而发挥抗脓毒症的作用。由此可见，黄连解毒汤主要发挥其抗炎、抗氧化应激等作用治疗脓毒症。

本研究基于网络药理学方法初步预测黄连解毒汤的活性成分、药物靶点及药物-疾病的相关通路，黄连解毒汤抗脓毒症具有多靶点、多途径、多通路的特点，其主要生物学机制可能与抑制各种炎症通路如TNF-α、IL-1β及T 细胞的分化相关。当然，本研究尚存在一些局限，如对有效成分相关靶点的寻找和确认方法需要进一步优化，而且本研究未进行实验验证，此次靶点及机制预测的可靠性需进一步研究。