生物制剂工艺特异性残留宿主蛋白ELISA检测方法的建立及验证

田易晓，王新月，窦向雅，韩翠翠，高珂，邵东燕，段苏杨，白岳丘，赵雯，黄庆生

西北工业大学生命学院空间生物科学与生物技术重点实验室，陕西西安 710072

采用重组DNA 技术制备的生物制剂是现代医药领域的重要产品之一，已成为制药业中发展最快、活力最强和技术含量最高的领域［1］。随着越来越多基因重组药物的出现，宿主细胞蛋白（host cell protein，HCP）及宿主DNA 残留问题也愈发引起人们的关注［2］。

用于重组表达的宿主细胞是包含数百至数千种HCP的复杂系统，极易对重组蛋白药物造成污染［3-4］。基因工程重组生物制剂中残留的HCP 作为外源蛋白，构成了生物制剂生产工艺过程中相关杂质的主要组成部分［5-6］，是产品的关键质量属性（critical quality attribute，CQA）。由于HCP 可能会引起不可预测的免疫反应［7-8］，相关法规要求对HCP 进行鉴定和定量［9-10］，并通过有效的下游工艺开发策略来解决该问题［11-14］，以保障用药安全。国际人用药品注册技术协调会的生物药品标准规格（ICH Q6B）指出［15］，对于HCP，通常使用较为灵敏的测定方法（如能够检测多种蛋白杂质的免疫测定），使用的多克隆抗体是通过用除去产物编码基因的生产用细胞、融合伴侣或其他合适的细胞系制品进行免疫接种而获得的。欧洲药品管理局（European Medicines Agency，EMA）指南CPMP／BWP／382／97指出，对于HCP，无论产品和生产工艺如何，均必须定期检测残余HCP［16］，因此，要求对HCP进行例行监测，采用适当的方法测定HCP的去除水平，批次之间的结果应保持一致并符合规定。最终制品中HCP 允许量根据具体情况确定，通常为1 ～100 ng／mg。依据宿主和表达产品的不同，HCP的允许量为0.01%～0.1%。

灵敏度高、重复性好的宿主蛋白检测方法不仅是保证生物制品安全有效的关键，也是生产过程控制和工艺优化的重要参数。目前，检测HCP 的主要方法有ELISA、SDS-PAGE 银染法、HPLC、毛细管电泳、质谱等［17-22］，这些方法均存在一定的优缺点，其中ELISA 法作为一种经典方法，由于其特异性好、灵敏度高、可定量及终点判断客观而被广泛应用，《中国药典》三部（2020 版）［23］收载的HCP 检测均采用双抗体夹心ELISA法［24-25］，此法可为生物制品生产工艺中HCP 残留的控制提供依据，以评价生物制剂生产工艺降低或去除非目的成分的能力，是一种国际通用的生物制剂HCP 检测方法。但商用HCP 试剂盒检测结果只代表通用的HCP 含量和比例［26-27］，而每个项目均有其特异的HCP 比例，而且各蛋白对HCP的检测干扰程度不同，因此建立专属的HCP 检测方法十分必要。本研究采用工艺特异性免疫学检测方法，即按产品生产、纯化工艺处理宿主细胞获得工艺特异的HCP，并用于制备标准品和检测抗体，这种采用相同工艺及表达体系的HCP作为免疫原制备获得的抗体具有更好的特异性，更能精确反映出产品中的残留蛋白。工艺特异性HCP免疫学检测方法越来越受到重视［28］，这种方法理论上可提高检测的灵敏性和特异性，但同时对整个生产条件的控制和工艺稳定性也提出了更高的要求。

1 材料与方法

1.1菌株、细胞及蛋白原液大肠埃希菌（ATCC35218）、酵母及CHO 细胞均由本实验室保存；大肠埃希菌重组表达的胰高糖素样肽（glucagon-like peptide，GLP）蛋白制剂原液由西北工业大学微生物与免疫实验室制备。

1.2实验动物 SPF 级新西兰白兔（雌性，2 月龄，体质量为2.0 ～2.5 kg）和SPF 级昆明小鼠（雌性，5 ～6周龄，体质量为25 g）购自西安交通大学医学部实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK（陕）2020-005。本实验均以科研为目的对实验动物进行养殖和使用，且按照《国家实验动物管理法规》（国务院令第676号）动物伦理相关规定进行。

1.3主要试剂及仪器 大肠埃希菌宿主蛋白残留检测试剂盒购自美国Cygnus technologies 公司；弗氏完全佐剂购自美国Sigma-Aldrich 有限公司；HRP 标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；TMB 底物溶液购自上海麦克林生化科技有限公司；ELISA 终止液购自北京索莱宝生物科技有限公司；一步法细菌／酵母／动物细胞活性蛋白提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；微量紫外分光光度计购自赛默飞世尔科技公司；多功能酶标仪购自美国Bio-Rad公司。

1.4溶液配制A液（0.06 mol／L NaAc）：取无水NaAc 0.492 2 g，加蒸馏水至100 mL；B液（0.06 mol／L HAc）：冰醋酸0.344 mL 加水至100 mL；0.06 mol／L 醋酸盐缓冲液（pH 4.8）：取上述A 液59 mL，与B液41 mL混合，用5 mol／L NaOH调pH至4.8。

1.5工艺特异性大肠埃希菌残留蛋白免疫血清的制备

1.5.2动物免疫 将空载大肠埃希菌截留液（不表达重组蛋白的标准大肠埃希菌按照表达重组蛋白大肠埃希菌培养和纯化获得的蛋白）用0.22 µm 滤膜过滤除菌，作为抗原，分别于第1、14、28、52 天免疫新西兰白兔1 只：取1 mg 抗原+1.5 mL 弗式完全佐剂混合至油包水状态，经背部皮下分4 点注射；分别于第1、14、30、65 天免疫昆明小鼠6 只：初次免疫每只0.08 mg 抗原+0.5 mL 弗式完全佐剂混合至油包水状态，经背部皮下分2 点注射，后续免疫每只0.08 mg抗原+0.7 mL生理盐水混匀，经腹腔注射。

1.5.3兔、鼠抗工艺特异性大肠埃希菌残留蛋白免疫血清的纯化 采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化免疫血清IgG抗体。家兔耳缘静脉采血，4 262×g离心10 min，取1份血清与2份0.06 mol／L醋酸盐缓冲液（pH 4.8）混合，室温搅拌下逐滴加入正辛酸33µL／mL 血清，室温混合10 min，4 ℃静置2 h，使其充分沉淀；4 ℃，9 590 ×g离心30 min，弃沉淀，上清经砂芯漏斗或125µm尼龙网过滤后，加入1／10体积的0.1 mol／L PBS（pH 7.4），用2 mol／L NaOH 调pH 至7.4，冰浴下于30 min 内加入0.277 g／mL 硫酸铵，使成45%饱和度，4 ℃静置1 h以上；4 ℃，6 660×g离心30 min，弃上清，沉淀用适量0.1 mol／L PBS（pH 7.4）溶解，于50倍体积的上述PBS中4 ℃，4 500×g超滤20 min，得到兔抗残留蛋白免疫血清。取少量样品适当稀释后，使用紫外分光光度计检测蛋白含量，并进行12%SDS-PAGE 鉴定。6 只小鼠分别经眼球采血，合并后4 262×g离心10 min分离血清，取血清用生理盐水按1∶1 000稀释备用，得到鼠抗残留蛋白免疫血清。

1.6大肠埃希菌残留蛋白双抗体夹心ELISA法的建立将上述得到的兔抗残留蛋白免疫血清纯化IgG 抗体包被酶标板，每孔5 µg（50 µg／mL），4 ℃包被过夜；用ELISA 洗涤液（1 mL Tween-20 加入1 000 mL 1×PBS 中,混匀）洗板，加入空载大肠埃希菌截留液标准品及待测样品，37 ℃孵育50 min；洗板3 次，加入鼠抗残留蛋白免疫血清（1∶1 000 稀释），37 ℃孵育50 min；洗板3 次，加入HRP 标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）（1∶40 000稀释），37 ℃孵育50 min；洗板5 次，加入TMB 底物溶液显色，37 ℃孵育10 min；加入ELISA终止液，于450 nm波长下测定吸光度值。

1.7标准曲线的绘制 将空载大肠埃希菌截留液标准品梯度稀释（338 pg／mL ～5 280 ng／mL），以浓度（ng／mL）为横坐标，A450值为纵坐标，利用四参数拟合绘制标准曲线，根据标准曲线计算待测样品中大肠埃希菌残留蛋白的含量。

1.8方法的验证

1.8.1特异性 用一步法细菌／酵母／动物细胞活性蛋白提取试剂盒分别提取大肠埃希菌、酵母及CHO 细胞蛋白，采用建立的双抗体夹心ELISA 法进行检测，以5 000 和50 ng／mL 空载大肠埃希菌截留液标准品作为阳性对照，样品稀释液作为阴性对照。

本试验过程中，小鼠各肠段肠黏膜SIgA呈现动态变化趋势，前3周逐渐上升，但在第4周的时候出现了全群下降，之后又恢复上升趋势，说明小鼠的免疫能力随着年龄的增长逐渐发展和完善，第4周的全群变化可能与气候突变导致应激所致。

1.8.2准确性 将大肠埃希菌重组表达的GLP 蛋白制剂原液分别与5、50 和100 ng／mL HCP 标准品等体积混合，作为低、中、高浓度样品，采用建立的双抗体夹心ELISA法重复测定3次，计算回收率及CV。

1.8.3检测限 采用建立的双抗体夹心ELISA 法平行测定10 份0 ng／mL 空载大肠埃希菌截留液标准品的A450，计算x±2SD，根据标准曲线计算得到相应的残留蛋白含量，即为该方法的检测限。

1.8.4精密性 将浓度为5、50 和100 ng／mL 的空载大肠埃希菌截留液标准品作为低、中、高浓度样品，在1 次试验内每个浓度平行检测10 次，每份设3个复孔，计算测定结果的CV，验证方法的试验内精密性。由两名实验员分别对上述3 个浓度的样品进行检测，计算测定结果的CV，验证不同人员的试验间精密性。

1.9样品测定 将大肠埃希菌重组表达的GLP 蛋白稀释至1 mg／mL，同时采用建立的方法和市售大肠埃希菌宿主蛋白残留检测试剂盒测定残留蛋白浓度。

1.10统计学分析 应用Graphpad prism 8.2.1软件处理数据，采用t检验进行显著性分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1工艺特异性大肠埃希菌残留蛋白免疫血清的鉴定

2.1.1工艺特异性大肠埃希菌残留蛋白的制备 空载大肠埃希菌按照表达GLP 肽大肠埃希菌工程菌株生产药用GLP 相同的纯化工艺流程，收集到了本工艺特异的HCP溶液，经5 K超滤浓缩后，获得1 mg／mL的工艺特异性大肠埃希菌HCP 10 mL。

2.1.2兔抗工艺特异性大肠埃希菌残留蛋白免疫血清的鉴定 经紫外分光光度计检测蛋白含量，测得兔抗残留蛋白IgG 抗体浓度为1.6 mg／mL；经12%SDS-PAGE分析，可见重链、轻链两条条带，相对分子质量分别约为50 000 和25 000，大小均与预期相符，见图1。

图1 兔抗残留蛋白IgG抗体的SDS-PAGE鉴定Fig.1 Identification of rabbit anti residual protein IgG antibody by SDS-PAGE

2.2标准曲线 空载大肠埃希菌截留液的浓度在338 pg／mL ～5 280 ng／mL 范围内，与A450值的四参数曲线呈良好拟合关系，拟合方程为：y=（A-D）／［1+（x／C）B］+D，其中A=0.928 39，B=-1.029 91，C=780.474 98，D=0.274 47，r2=0.998 46。见图2。

图2 标准品的拟合曲线Fig.2 Fitting curve of standard

2.3方法的验证

2.3.1特异性 大肠埃希菌裂解蛋白、阳性对照和阴性对照A450的P／N 值均＞2.88，CHO 和酵母细胞裂解蛋白的A450值与阴性对照接近，无交叉反应，见表1。表明该方法专属性良好。

表1 方法的特异性验证结果Tab.1 Verification for specificity

2.3.2准确性 采用建立的方法测定低、中、高3 个浓度样品的回收率分别为90.9%、93.5%和107.9%，均在80% ～120%范围内；CV分别为7.3%、2.5%和5.7%，均小于15%，符合验证要求。见表2。

表2 方法的准确性验证结果Tab.2 Verification for accuracy

2.3.3检测限 用建立的方法平行检测10份0 ng／mL空载大肠埃希菌截留液标准品的A450值，根据标准曲线计算x± 2SD的A450值对应的残留蛋白浓度为338 pg／mL，即为该方法的检测限。已知浓度的工艺特异性残留蛋白进行系列梯度稀释后，本ELISA方法检测的灵敏度可达338 pg／mL。

2.3.4精密性 采用建立的方法测定低、中、高浓度空载大肠埃希菌截留液标准品的试验内CV分别为4.0%、4.7%和5.8%，试验间CV分别为12.0%、8.5%和9.1%，见表3。表明该方法精密性良好。

表3 方法的精密性验证结果Tab.3 Verification for precision

2.4样品测定 大肠埃希菌重组表达的GLP 蛋白通过建立的ELISA法能检出（17.11±0.96）ng／mL的残留蛋白，而市售试剂盒只能检出（6.58±0.18）ng／mL的残留蛋白，二者差异有统计学意义（t=18.67，P＜0.000 1），约有62%的残留蛋白未被市售非工艺特异性ELISA 试剂盒检出，这些残留蛋白应为本工艺特异的残留蛋白。

3 讨论

本研究以重组GLP 大肠埃希菌的发酵、提取、纯化工艺为特定生产工艺，对空载大肠埃希菌（不表达GLP 的大肠埃希菌）进行模拟GLP 的提取纯化过程，获得工艺特异的HCP，并以其为免疫原，制备了特异性的抗HCP 多克隆抗体，建立了具有工艺特异性的大肠埃希菌残留蛋白双抗体夹心ELISA 法，为GLP多肽药物的生产质控体系提供了特异、精确的HCP定量检测方法。检测结果表明，建立的ELISA 法可检测到的HCP 最低浓度达338 pg／mL；针对同一GLP制剂样品，分别采用非工艺特异性的市售ELISA 试剂盒和本研究建立的的工艺特异性ELISA 法进行残留蛋白检测，与工艺特异性ELISA 法所检出的制剂中残留蛋白总量相比，约有62%的残留蛋白未被市售非工艺特异性ELISA 试剂盒检出，这些残留蛋白应为本工艺特异的残留蛋白。建立的工艺特异的HCP检测方法是近年来基因重组生物制剂质控体系中HCP 定标的新方法，其更具针对性，能更精确地反映出产品的HCP 残留量。法国Pierre Fabre 免疫中心报道了一种基于ThresholdTM系统且工艺特异的检测疫苗中大肠埃希菌HCP 的方法，该方法用不含目的基因的大肠埃希菌蛋白制备羊多克隆抗体，采用免疫印迹法检测其产品生产过程中的HCP，获得了良好的效果［31］。与HCP相关的风险通常通过下游工艺能力、残留HCP水平、最大剂量、给药途径、给药频率、毒理学数据和临床数据相结合进行评估。HCP 残留是工艺稳定性监测的重要评价指标，是重组疫苗和药物的重要质控指标，随着生物技术的发展，HCP 检测方法将得到进一步完善，并在生物制品检测中发挥重要作用。